[發(fā)明專利]一種磁珠偶聯(lián)因子復(fù)合物及擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202211494461.X
• 申請(qǐng)日: 2022-11-25
• 公開（公告）號(hào): CN115896018A
• 公開（公告）日: 2023-04-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王芝輝;徐娟;曹啟龍;梁少帥;董友玉;張文茜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 青島海爾生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/0783
• 分類號(hào): C12N5/0783
• 代理公司: 山東竹森智壤知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37382
• 代理人: 劉文容

本發(fā)明提供了一種磁珠偶聯(lián)因子復(fù)合物及擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法，屬于生物免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種磁珠偶聯(lián)因子復(fù)合物，包括磁珠、4?1BBL，IL21，MICA；磁珠偶聯(lián)因子復(fù)合物在制備NK細(xì)胞中的應(yīng)用及擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法；本發(fā)明提供的磁珠偶聯(lián)因子復(fù)合物，能夠富集在細(xì)胞團(tuán)周圍，持續(xù)作用，對(duì)NK細(xì)胞的激活和擴(kuò)增作用更優(yōu)，本發(fā)明制備的NK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)、NK陽性率，作用效果更優(yōu)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種磁珠偶聯(lián)因子復(fù)合物及擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)

研究表明自然殺傷(Natural?Killer，NK)細(xì)胞能誘導(dǎo)有效的抗腫瘤、抗感染免疫反應(yīng)，無需預(yù)先刺激，通過使用穿孔素和顆粒酶以及其它機(jī)制，無MHC限制性殺傷腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞。異體NK細(xì)胞移植幾乎不會(huì)導(dǎo)致移植物抗宿主病(GVHD)和細(xì)胞因子風(fēng)暴(CRS)，有望成為一種“現(xiàn)貨型”的產(chǎn)品。根據(jù)clinicaltrials數(shù)據(jù)庫顯示，截止2022年9月19日，全球范圍內(nèi)NK細(xì)胞免疫療法相關(guān)的臨床試驗(yàn)有397例正在進(jìn)展中，臨床結(jié)果顯示，NK療法治療復(fù)發(fā)或難治性非霍奇金淋巴瘤患者，大多數(shù)產(chǎn)生了臨床緩解，且未出現(xiàn)主要的毒性作用。

但是NK細(xì)胞在外周血中比例小，體外擴(kuò)增難，擴(kuò)增后細(xì)胞毒活性弱，都是限制其應(yīng)用于臨床免疫治療的瓶頸。現(xiàn)有的NK細(xì)胞制備方法主要有飼養(yǎng)層法、因子法。飼養(yǎng)層法主要使用輻照后的K562細(xì)胞，或者工程化改造K562細(xì)胞，激活及擴(kuò)增效果較好，但具有潛在的風(fēng)險(xiǎn)，安全性低。因子法沒有外源風(fēng)險(xiǎn)因素加入，安全性較好，但需要預(yù)先包被，操作繁瑣，激活和擴(kuò)增NK細(xì)胞效果由于樣本差異不穩(wěn)定。

中國(guó)專利文獻(xiàn)CN107354133A(申請(qǐng)?zhí)枺?01710767822.6)公開了磁珠偶聯(lián)多種刺激蛋白的體外擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法及應(yīng)用。主要為加入偶聯(lián)了IL-15、4-1BBligand和IL-21的磁珠(三者摩爾比為1～3:1～3:1～3)，體外擴(kuò)增NK細(xì)胞。

中國(guó)專利文獻(xiàn)CN113755436A(申請(qǐng)?zhí)枺?02110784595.4)公開了一種體外NK細(xì)胞的擴(kuò)增方法及其NK細(xì)胞。主要為采用含有偶聯(lián)蛋白磁性微球上偶聯(lián)有IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA中的至少一種。該發(fā)明將NK細(xì)胞生長(zhǎng)所需要的多個(gè)激活及擴(kuò)增信號(hào)蛋白分子偶聯(lián)到磁性微球表面，使用偶聯(lián)蛋白磁性微球進(jìn)行NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)。

現(xiàn)有技術(shù)中雖然已有關(guān)于磁珠與因子偶聯(lián)擴(kuò)增NK細(xì)胞的研究報(bào)道，但是具體方法和效果與本發(fā)明有明顯差異。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明公開了一種磁珠偶聯(lián)因子復(fù)合物及擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法。

本發(fā)明避免了NK細(xì)胞與其它來源細(xì)胞共培養(yǎng)的問題，在降低風(fēng)險(xiǎn)的基礎(chǔ)上還可以獲得大量高純度高功能的NK細(xì)胞。

本發(fā)明的目的是采用新穎的方法獲得高效擴(kuò)增的NK細(xì)胞，具有良好的安全性和穩(wěn)定性，操作簡(jiǎn)單。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種磁珠偶聯(lián)因子復(fù)合物，包括磁珠、4-1BBL，IL21，MICA。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，磁珠粒徑為300nm-4.5um。

進(jìn)一步優(yōu)選的，磁珠粒徑為300nm。

上述磁珠偶聯(lián)因子復(fù)合物的制備方法，包括如下步驟：

①將4-1BBL、IL21、MICA生長(zhǎng)因子分別置于0.1-0.5M硼酸緩沖液中，制得生長(zhǎng)因子溶液，將生長(zhǎng)因子溶液與磁珠混合孵育，4℃以下旋轉(zhuǎn)混勻16-24h，孵育結(jié)束后，在無菌條件下置于磁性條件下靜置，棄去上清液，然后用封閉液洗滌后，再用封閉液重懸，4℃以下旋轉(zhuǎn)混勻16-24h，制得各單一生長(zhǎng)因子磁珠組合物，分別為磁珠偶聯(lián)4-1BBL組合物、磁珠偶聯(lián)IL21組合物、磁珠偶聯(lián)MICA組合物；