[發明專利]固定化酶、其制備方法及應用

在審

• 申請號: 202211475955.3
• 申請日: 2022-11-23
• 公開（公告）號: CN115678881A
• 公開（公告）日: 2023-02-03
• 發明（設計）人: 洪浩;詹姆斯·蓋吉;張娜;張春月;崔瑜霞;趙佳東;陳俊
• 申請（專利權）人: 凱萊英生命科學技術（天津）有限公司;凱萊英藥業（江蘇）有限公司
• 主分類號: C12N11/089
• 分類號: C12N11/089;C12N11/14;C12N13/00;C12N9/02;C12N9/04;C12N9/06;C12N9/10
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 金田蘊

本發明公開了一種固定化酶、其制備方法及應用。該制備方法包括以下步驟：S1，向待固定的酶中加入PEI，然后加入無官能團修飾的Fe₃O₄顆粒，進行攪拌，PEI包覆Fe₃O₄顆粒，得到第一反應體系；S2，向第一反應體系中加入蛋白沉淀劑進行蛋白的沉淀，得到第二反應體系；S3，向第二反應體系中加入交聯劑交聯形成磁性交聯酶聚集體；優選的，待固定的酶為酶液。應用本發明的技術方案，制備磁性交聯酶聚集體，具有結構性質穩定，粒徑分布均勻，磁性好的優點，而且對于制備工藝來說，制備簡單、生產成本低、工藝重現性好、可操作性強、放大生產簡單等。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體而言，涉及一種固定化酶、其制備方法及應用。

背景技術

酶是由活細胞產生的具有催化作用的生物催化劑，由于其高效的催化機制、獨特的底物選擇性以及反應的可控性，使其在化學、生物工程學及藥品生產等領域具有廣闊的應用前景。而且生物催化劑本質為無毒，對環境友好的蛋白質，已經替代了許多傳統的化學催化劑。相較于傳統的游離酶，固定化酶具有穩定性增加，易從反應系統中分離，且易于控制，能反復多次使用，便于運輸和貯存，有利于自動化生產等優點，所以，固定化酶已經逐漸取代游離酶在工業生產、化學分析和醫藥等方面被廣泛應用。

傳統的固定化方法主要有吸附法、包埋法、共價結合法等，這些方法都需要其他載體的參與，把酶分子在不同的原理下結合在載體上，從而實現回收方便的特性。而無載體酶固定化的方法CLEAs(Cross-Linking Enzyme Aggregates)是使用戊二醛作為交聯劑把處于沉淀狀態的酶分子固定下來，所得到的固定化酶顯示了良好的催化活性，具有成本低，高比表面積，高活性與耐受性高等優點。

但是傳統無載體固定化酶具有顆粒大小不均勻，機械穩定性差，回收困難等缺點，面對這些難題，國內外對磁性交聯酶聚集體M-CLEAs(Magnetic-CLEAs)的研發興趣日益濃厚。磁性交聯酶聚集體是一種新型的固定化酶，能夠借助外部磁場進行分離、回收，可克服無載體固定化酶的缺陷。目前大部分磁性交聯酶聚集體都是以磁性鐵氧化物顆粒進行硅烷化或者進行其他的基團修飾后再固定，應用于海藻糖合酶、β-半乳糖苷酶、磷脂酶等酶的固定化，提高了酶的使用效率。

目前，磁性高分子微球為磁性交聯酶聚集體制備所需的熱門磁性材料。磁性高分子微球的性質取決于無機磁性物質、高分子材料及其相互作用方法。無機磁性物質應用最廣泛的為四氧化三鐵(Fe₃O₄)，大部分是由氯化鐵、硫酸鐵或者硝酸鐵等經過復雜工藝如沉淀法、微乳化法等制備而成，制備過程復雜，成本高。進一步又需要將四氧化三鐵磁性微球通過共聚或者表面改性等方法使其表面帶有特殊功能基團(如-OH，-CHO，-COOH，-NH₂等)，制備方法主要包括包埋法、單體共聚法等。其中，包埋法是通過超聲分散將磁性粒子均勻分布于高分子溶液中，通過霧化、絮凝、沉積、蒸發等操作使聚合物固化包埋磁性粒子，得到磁性高分子微球，但是存在粒徑分布寬、微球形狀不規則的問題。單體共聚法是在磁性粒子與高分子物質共同存在下，根據不同聚合方式引入引發劑、表面活性劑、穩定劑等物質聚合，制備磁性高分子微球，雖然單體共聚法制備的磁性高分子微球在粒徑分布以及分散性方面比包埋法有所提高，但存在磁性微粒含量低、磁微粒分布不均等問題。

以上方式得到的磁性高分子微球雖然功能性強但是制備工藝復雜，使用的高分子材料多，相應地很大程度上提高了生產成本。

發明內容

本發明旨在提供一種固定化酶、其制備方法及應用，以解決現有技術中磁性交聯酶聚集體制備工藝復雜、成本高的技術問題。