[發明專利]一種RNA-DNA嵌合接頭及其應用

有效

• 申請號: 202211473395.8
• 申請日: 2022-11-21
• 公開（公告）號: CN116478983B
• 公開（公告）日: 2023-10-24
• 發明（設計）人: 張寧
• 申請（專利權）人: 北京普譯生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/6869;C12Q1/6806
• 代理公司: 北京知元同創知識產權代理事務所(普通合伙) 11535
• 代理人: 劉元霞

本發明提出一種RNA?DNA嵌合接頭及其應用，屬于生物分析檢測以及基因測序領域，尤其涉及一種用于確保單個解旋酶結合以及阻滯解旋酶移動的測序接頭序列設計、構建方法以及應用。采用RNA結合DNA的方式，特異性保證解旋酶在接頭上的結合位置、個數等；而RNA?DNA雜合結構具有比單獨RNA雙鏈結構更穩定的特性，并且只能被RNaseH所識別(RNaseH特異性識別RNA?DNA雜合結構)，切除RNA?DNA雜合結構中的RNA鏈，從而暴露出作為引導鏈的單鏈DNA。adapter引入Cy3，Cy3能夠有效阻滯Dda。本發明所述的RNA?DNA嵌合adapter主要應用在納米孔測序中，通過本發明實驗的系統驗證，該adapter以及adapter?mix能夠有效進行納米孔測序。

技術領域

本發明屬于生物分析檢測以及基因測序領域，尤其涉及一種RNA-DNA嵌合接頭及其應用。

背景技術

納米孔測序技術是近年被開發出來的新型核酸測序技術。依據孔道類型可分為固態孔和生物納米孔，生物納米孔即能夠允許底物通過的孔道蛋白，以下納米孔測序單指生物納米孔測序技術。在電場力的作用下，帶電核酸底物能夠通過生物納米孔。當核酸通過納米孔時，能夠阻礙納米孔的電流，產生不同的電流信號，通過對電流信號的解析，可以獲得核酸的堿基信息。

測序常用底物多為雙鏈DNA或RNA，而雙鏈核酸無法自由穿過納米孔，需要能將核酸雙鏈解旋形成單鏈，或者采用聚合的方式，以雙鏈核酸為模板合成單鏈，因此，在納米孔測序過程中，多采用解旋酶或者聚合酶等生物酶來得到由雙鏈產生單鏈的目的。此外，電場力作用下(180mV)，單鏈核酸底物穿過納米孔速度過快，以至于檢測電流無法記錄。所以還需要對待測單鏈核酸進行限速，此時解旋酶或者聚合酶本身的活性(解旋效率，聚合效率)都能起到限速的作用。

測序過程中，接頭(adapter)是由長度不同的互補DNA退火形成的單雙鏈結構(overhang，圖1)，它的主要作用是，1.單鏈區作為引導序列，將adapter與解旋酶復合物(adapter?mix)引向孔道附近，產生底物過孔電場力；2.后續雙鏈區連接待測雙鏈DNA底物；3.單雙鏈交會區，結合解旋酶，并將解旋酶阻滯于此，在產生過孔電場力前不能解開雙鏈結構(在由ATP和Mg²⁺條件下)。單鏈區可以結合多個解旋酶(多數解旋酶在無ATP和Mg²⁺會停在單雙鏈嵌合位置)，這樣會造成引導序列短，還可以引起多個解旋酶作用存在差異，使得解旋效率變低。已有專利(WO2014135838A1)，常用策略是采用iSp18、iSpC3等不含堿基基團的核苷酸類似物來阻滯或者封堵解旋酶的結果，在保證引導序列足夠長的前提下，常用多個iSp18等核苷酸類似物(非天然氨基酸)串聯。這種方案首先合成這些類似物存在較大難度，步驟繁瑣，串聯效率低且串聯個數較多時，鏈容易斷裂。不均一的adapter會影響解旋酶的結合數量，阻滯效果，從而影響測序效率；其次，合成成本較高。因此，保證單個解旋酶結合在adapter上，以及阻滯解旋酶的方案存在需要。

發明內容

采用RNA結合DNA的方式，特異性保證解旋酶在接頭上的結合位置、個數等；而RNA-DNA雜合結構具有比單獨RNA雙鏈結構更穩定的特性，并且只能被RNaseH所識別(RNaseH特異性識別RNA-DNA雜合結構)，切除RNA-DNA雜合結構中的RNA鏈，從而暴露出作為引導鏈的單鏈DNA。在RNA結合時，adapter單鏈區只允許一個解旋酶分子結合，以此排除多個解旋酶結合，對于解旋活性以及多個解旋酶對adapter引導序列結合使得待測樣品進孔效率變差。同時，為了阻止解旋酶在接頭上的非目的性移動(接頭制備過程，測序過程，ATP等需要先與待測DNA孵育，此時解旋酶會具有活性而解開雙鏈DNA區域)，本發明還提供一種解旋酶的阻滯方案，即在單雙鏈交會處引入Cy3(四甲基吲哚-碳菁)，Cy3在ATP和Mg²⁺存在的條件下，無外加電場時，Cy3能夠有效阻滯Dda的解旋能力。經過鑒定，本發明所述方案能夠產生有效的納米孔測序數據。