[發明專利]一種RNA-DNA嵌合接頭及其應用

有效

• 申請號: 202211473395.8
• 申請日: 2022-11-21
• 公開（公告）號: CN116478983B
• 公開（公告）日: 2023-10-24
• 發明（設計）人: 張寧
• 申請（專利權）人: 北京普譯生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/6869;C12Q1/6806
• 代理公司: 北京知元同創知識產權代理事務所(普通合伙) 11535
• 代理人: 劉元霞

1.一種用于表征靶多核苷酸的嵌合接頭，其特征在于，所述嵌合接頭包含三段核酸：核酸A、核酸B和核酸C；

核酸A是DNA，從5’到3’包含四段區域a4、a1、a2、a3；a1為引導區區域，同時與核酸C的RNA片段結合、封阻多核苷酸結合蛋白的結合；a2為多核苷酸結合蛋白結合和阻滯區區域；a3為形成互補雙鏈區區域，同時與靶多核苷酸連接；a4為引導區a1的補充區域；

核酸B是DNA，包含b3區域，5’端含有磷酸化，b3為與核酸A中的a3區域形成互補的區域；

核酸C為RNA，包含c1區域，c1為與核酸A中的a1區域形成互補的區域。

2.根據權利要求1所述的嵌合接頭，其特征在于，

核酸A的a2區域中還包含阻滯化合物Cy3。

3.根據權利要求1或2所述的嵌合接頭，其特征在于，

核酸A中，a1的序列如SEQ?ID?NO2所示，

和/或，a2的序列如SEQ?ID?NO3所示，

和/或，a3的序列如SEQ?ID?NO4所示，

和/或，a4的序列如SEQ?ID?NO5所示。

4.根據權利要求1-3任一項中所述的嵌合接頭，其特征在于，

核酸A的序列如SEQ?ID?NO1所示；

和/或，核酸B的序列如SEQ?ID?NO6所示；

和/或，核酸C的序列如SEQ?ID?NO7所示。

5.根據權利要求1-4任一項中所述的嵌合接頭，其特征在于，

嵌合接頭的序列如SEQ?ID?NO1、SEQ?ID?NO6和SEQ?ID?NO7所示。

6.根據權利要求1-5任一項中所述的嵌合接頭，其特征在于，

所述靶多核苷酸是完全雙鏈多核苷酸、部分雙鏈多核苷酸或單鏈多核苷酸。

7.一種用于表征靶多核苷酸的復合物，其特征在于，所述復合物包含多核苷酸結合蛋白和權利要求1-6任一項中所述的嵌合接頭。

8.根據權利要求7所述的復合物，其特征在于，

所述多核苷酸結合蛋白衍生自多核苷酸處理酶；優選地，所述多核苷酸處理酶選自聚合酶、解旋酶或核酸外切酶；更優選地，所述多核苷酸處理酶為解旋酶；最優選地，解旋酶為T4?Dda解旋酶(E94C/C109A/C136A/A360C)。

9.根據權利要求7或8所述的復合物，其特征在于，

用于表征靶多核苷酸的復合物只結合單個多核苷酸結合蛋白。

10.權利要求7-9任一項中所述的用于表征靶多核苷酸的復合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)合成核酸A、B和C，并用不含RNA酶的TE緩沖液溶解；

2)等體積混合核酸A、B和C，PCR儀緩慢降溫退火，形成RNA-DNA嵌合結構；

3)將RNA-DNA嵌合結構與多核苷酸結合蛋白孵育；

4)孵育結束后使用分子篩將多余的多核苷酸結合蛋白分離去除；

5)純化后的接頭與多核苷酸結合蛋白復合物，使用RNase?H進行消化；

6)消化后再經分子篩純化，去除RNase?H，得到表征靶多核苷酸的復合物。