[發明專利]表達耐鹽蛋白酶的重組質粒、酵母工程菌及其發酵培養基和應用

在審

• 申請號: 202211462590.0
• 申請日: 2022-11-22
• 公開（公告）號: CN115851808A
• 公開（公告）日: 2023-03-28
• 發明（設計）人: 黃明濤;劉秀妨;徐家霖;肖寒;馮云子;趙謀明
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N1/19;C12N15/57;C12P21/06;C12R1/865
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 蘇運貞

1.一種表達耐鹽蛋白酶的重組質粒，其特征在于：在表達質粒中插入原生信號肽、原生前導肽和酶功能區；

所述的原生信號肽的核酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述的原生前導肽的核酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述的酶功能區的核酸序列如SEQ ID No.3所示。

2.根據權利要求1所述的重組質粒，其特征在于：所述的表達質粒為CPOTud、p426GPD、p426TEF、p426ADH、p426CYC、p416GPD、p4216TEF、p4126ADH、p416CYC、p425GPD、p425TEF、p425ADH、p425CYC、p415GPD、p4215TEF、p4125ADH、p415CYC、p424GPD、p424TEF、p424ADH、p424CYC、p414GPD、p4214TEF、p4124ADH、p414CYC、p423GPD、p423TEF、p423ADH、p423CYC、p413GPD、p4213TEF、p4123ADH、p413CYC、pSP-GM1、pRS303、pRS304、pRS305、pRS306、pRS413、pRS414、pRS415、pRS416、pRS423、pRS424、pRS425或pRS426。

3.一種表達耐鹽蛋白酶的酵母工程菌，其特征在于：是將權利要求1或2所述的重組質粒轉化出發酵母菌株后得到。

4.根據權利要求3所述的表達耐鹽蛋白酶的酵母工程菌，其特征在于：所述的出發酵母菌株為釀酒酵母B184M、CEN.PK 530.1C、CEN.PK 113.5D、BY4742、BY4741、CEN.PK2-1D、CEN.PK2-1C或IMX581。

5.一種發酵培養基，其特征在于：

適合于權利要求3所述的表達耐鹽蛋白酶的酵母工程菌；

是在YPD培養基中添加Ca2⁺和/或Zn2⁺；

所述Ca²⁺的濃度為1-20mM，所述Zn²⁺的濃度為0.05-0.8mM。

6.根據權利要求5所述的發酵培養基，其特征在于：所述Ca²⁺的濃度為5mM，所述Zn²⁺的濃度為0.4mM。

7.權利要求1或2所述的重組質粒，或者權利要求3或4所述的酵母工程菌在生產耐鹽蛋白酶中的應用。

8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，包括以下步驟：

將權利要求3或4所述的酵母工程菌接種至權利要求5或6所述的發酵培養基，在30-37℃下培養96h以上。

9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，包括以下步驟：

將權利要求3或4所述的酵母工程菌的發酵液通過超濾管反復過濾除去大部分色素蛋白，然后上樣離子交換柱，通過分管收集穿透液得到電泳純級耐鹽蛋白酶；

所述的超濾管的截留分子量大小為10kDa、30kDa或50kDa；

所述的離子交換柱為Q強陰離子交換柱或DEAE弱陰離子交換柱。

10.權利要求1或2所述的重組質粒，或者權利要求3或4所述的酵母工程菌在降解大豆分離蛋白中的應用。