[發明專利]一種在微流場中利用化學-酶級聯反應生成2-喹啉羧酸的方法及裝置

在審

• 申請號: 202211453992.4
• 申請日: 2022-11-21
• 公開（公告）號: CN115850168A
• 公開（公告）日: 2023-03-28
• 發明（設計）人: 郭凱;黃桂翔;胡玉靜;潘婕;王雨清;王合永;趙明業;何長安;李吟舟;方正;朱寧
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C07D215/48
• 分類號: C07D215/48;C12P13/00;C12M1/40;C12M1/00;B01J19/00
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 肖明芳

1.一種在微流場中利用化學-酶級聯反應生成2-喹啉羧酸的方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1：以鄰硝基苯甲醛溶解于有機溶劑得到溶液A，丙酮酸鈉溶解于磷酸鹽的緩沖液得到溶液B，將溶液A、溶液B同時泵入固定有丙酮酸依賴性醛縮酶NahE的第一微通道反應器中，在第一微通道反應器中將鄰硝基苯甲醛催化成4-(2-硝基苯基)-2-氧代丁-3-烯酸；

S2：將鐵粉固定到第二微通道反應器中，將步驟S1得到的反應液與鹽酸溶液混合調整pH為2~4后，注射到第二微通道反應器中，從而將4-(2-硝基苯基)-2-氧代丁-3-烯酸還原得到2-喹啉羧酸。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S1中，所述丙酮酸依賴性醛縮酶NahE為來源于Pseudomonas putida的反式-o-羥基亞芐基丙酮酸水合酶-醛縮酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟S1中，溶液A和溶液B的摩爾比為1∶1～3。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S1中，丙酮酸依賴性醛縮酶NahE通過如下方法制備：將核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的丙酮酸依賴性醛縮酶NahE的基因構建到pET-28a（+）載體上，并轉入到大腸桿菌BL 21（DE 3）中，培養并純化得到對應的丙酮酸依賴性醛縮酶NahE。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S1中，丙酮酸依賴性醛縮酶NahE通過如下方法固定在第一微通道中：將培養并純化得到的醛縮酶酶分散于浸有樹脂的磷酸鹽緩沖液中，于20~22℃下緩慢攪拌后，取出樹脂，于凍干機中除水，然后將干燥的固定化樹脂填充到微通道中；將定量的鐵粉與水混合的懸濁液快速通入管道內，再將管道纏繞在磁鐵上從而固定微通道內的鐵粉。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述樹脂為水性吸附樹脂ES-1、ES-103B和ES-108中的任意一種；樹脂、丙酮酸依賴性醛縮酶NahE純酶的用量比為500~1500 mg：1 mg。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S1中，所述有機溶劑為正庚烷、甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、二甲基亞砜中的任意一種或幾種；鹽酸溶液濃度為50 mM；磷酸鹽的緩沖溶液為KH₂PO₄/K₂HPO₄或NaH₂PO₄/Na₂HPO₄，pH值為6～8，緩沖溶液中磷酸鹽的總濃度為50mmol·L^-1～200 mmol·L^-1。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S1中，反應的溫度為25~35℃，反應的停留時間為15~60 min，反應器中的管道為聚四氟乙烯管，內徑為2~3mm，管道體積為2~4ml；步驟S2中，反應的溫度為85~100℃，反應的停留時間為30~60 min，反應器中的管道為聚四氟乙烯管，內徑為2~3 mm，管道體積為2~4 ml。

9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S1和S2中所述鄰硝基苯甲醛、NahE、鐵粉的用量比為50~150 mM：1 mg：500 mg。

10.一種在微流場中利用化學-酶級聯反應生成2-喹啉羧酸的裝置，其特征在于，所述裝置包括第一進料泵、第二進料泵、第三進料泵、第一微通道反應器和第二微通道反應器；其中，第一進料泵和第二進料泵通過管道以并聯的方式連接到第一微通道反應器上，所述第一微通道反應器與第二微通道反應器串聯，所述第三進料泵與第二微通道反應器相連；所述第一微通道反應器中固定有丙酮酸依賴性醛縮酶NahE；所述第二微通道反應器中固定有鐵粉。