[發明專利]一種分泌表達人白介素10的大腸桿菌益生菌構建方法

在審

• 申請號: 202211448528.6
• 申請日: 2022-11-18
• 公開（公告）號: CN115896148A
• 公開（公告）日: 2023-04-04
• 發明（設計）人: 徐煒;朱玨;李源濤;張幫周;何劍全;肖傳興
• 申請（專利權）人: 上海承葛醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/24;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京挺立專利事務所(普通合伙) 11265
• 代理人: 阮錦華

1.一種分泌表達人白介素10的大腸桿菌益生菌構建方法，其特征在于通過大腸桿菌CRISPR/Cas9雙質粒系統pEcCas/pEcgRNA，對EcN菌進行改造，使其能表達人白介素10并分泌至胞外；首先構建了人白介素10表達框，包含阿拉伯糖啟動子P_BAD、大腸桿菌外膜蛋白ompF信號肽、人白介素10基因序列和終止子T1等元件；再將人白介素10表達框通過CRISPR插入已構建的胞壁脂蛋白缺失菌株EcN-Δlpp基因組中，構建無抗性標記、分泌表達人白介素10的基因工程菌EcN-Δlpp-IL10。

2.如權利要求1所述的分泌表達人白介素10的大腸桿菌益生菌構建方法，其特征在于包括步驟如下：

S1、pEcgRNA-N20載體構建，設計靶點N20，并由此搭建pEcgRNA-N20載體；

其中，設計靶點N20包括：設計CRISPR靶點N20序列：N20-F、N20-R，進行合成；其中，N20-F的序列為：TAGTGGTAAAACGAGACATCGCCC，N20-R的序列為：AAACGGGCGATGTCTCGTTTTACC；

搭建pEcgRNA-N20載體包括：使用BsaⅠ-HF限制性內切酶對pEcgRNA載體進行酶切，與N20靶點接頭進行T4連接；

S2、重疊PCR獲得IL-10表達框，所述IL-10表達框含有阿拉伯糖啟動子P_BAD、大腸桿菌外膜蛋白ompF信號肽、人白介素10基因序列和終止子T1，對人白介素10基因序列進行密碼子優化、合成，作為PCR擴增的模板，ompF信號肽、T1基因序列進行合成作為PCR擴增的模板；表達框還具有插入位點(即靶點)的上游同源片段up和下游同源片段down，設計擴增引物，進行PCR擴增，獲得上游同源片段up、下游同源片段down、阿拉伯糖啟動子P_BAD、ompF信號肽、人白介素10IL-10、終止子T1片段的PCR擴增產物，再通過重疊PCR，獲得IL-10表達框up-P_BAD-ompF-IL10-T1-down；

S3、pEcgRNA-N20-IL10載體構建；

將IL-10表達框PCR擴增產物進行凝膠電泳，pEcgRNA-N20載體使用HindIII-HF、XhoI限制性內切酶進行酶切；然后對pEcgRNA-N20酶切載體和IL-10表達框up-P_BAD-ompF-IL10-T1-down進行同源重組連接，篩選出pEcgRNA-N20-IL10載體；

S4、CRISPR插入IL-10表達框；

使用pEcgRNA-N20-IL10載體轉化已制備好的含pEcCas質粒的EcN-Δlpp感受態，通過CRISPR將IL-10表達框插入EcN-Δlpp基因組中；

S5、質粒消除；采用單克隆菌和LB+kana+鼠李糖消除pEcgRNA-N20-IL10質粒及采用純LB養基和LB+蔗糖消除pEcCas質粒，獲得EcN-Δlpp-IL10菌株。

3.如權利要求1所述的分泌表達人白介素10的大腸桿菌益生菌構建方法，其特征在于進一步包括如下步驟：

S6、誘導表達；取EcN-Δlpp-IL10菌株于LB平板培養基上劃線培養，挑取單克隆菌落于LB液體培養基中搖菌，然后接種到LB培養基中培養至OD₆₀₀值0.6，再加入誘導劑阿拉伯糖誘導培養；

S7、Western?Blot檢測；

將制備好的誘導上清、誘導周質、誘導菌體和非誘導上清、周質、菌體蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，電泳后按電壓100V、時間45min條件進行轉膜；轉膜后PVDF膜使用TBST配制的5％脫脂乳粉中封閉3h，更換新的5％脫脂乳粉，按1:2500比例添加一抗，4℃冰箱過夜(約16h)；然后進行TBST洗膜5次，更換新的5％脫脂乳粉，按1:7500比例添加二抗，室溫慢搖2h；再經過5次TBST洗膜，洗膜后使用凱基生物ECL檢測試劑盒顯影。

4.如權利要求1所述的分泌表達人白介素10的大腸桿菌益生菌構建方法，其特征在于步驟S1中，將10μL?N20-F與10μL?N20-R混合，退火制備N20靶點接頭，條件為95℃，5min；25℃，∞。