[發明專利]一種分泌表達人白介素10的大腸桿菌益生菌構建方法

在審

• 申請號: 202211448528.6
• 申請日: 2022-11-18
• 公開（公告）號: CN115896148A
• 公開（公告）日: 2023-04-04
• 發明（設計）人: 徐煒;朱玨;李源濤;張幫周;何劍全;肖傳興
• 申請（專利權）人: 上海承葛醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/24;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京挺立專利事務所(普通合伙) 11265
• 代理人: 阮錦華

本發明公開了一種分泌表達人白介素10的大腸桿菌益生菌構建方法，通過大腸桿菌CRISPR/Cas9雙質粒系統pEcCas/pEcgRNA，對EcN菌進行改造，使其能表達人白介素10并分泌至胞外；首先構建了人白介素10表達框，包含阿拉伯糖啟動子P_BAD、大腸桿菌外膜蛋白ompF信號肽、人白介素10基因序列和終止子T1等元件；再將人白介素10表達框通過CRISPR插入已構建的胞壁脂蛋白缺失菌株EcN?Δlpp基因組中，構建無抗性標記、分泌表達人白介素10的基因工程菌EcN?Δlpp?IL10。本發明構建的菌株與此前構建的分泌表達人胰島素原的EcN?Δlpp?INS菌株可協同作用，遞送抗原人胰島素原和細胞因子白介素10至腸粘膜，針對I型糖尿病誘導形成免疫耐受，保留殘留的β細胞功能，改善I型糖尿病癥狀甚至逆轉新發的I型糖尿病。

技術領域

本發明屬于微生物技術領域，特別涉及一種分泌表達人白介素10的大腸桿菌益生菌構建方法。

背景技術

大腸桿菌Nissle?1917(Escherichia?coli?Nissle?1917，EcN)是由AlfredNissle于1917年分離得到的優質益生菌，現作為益生制劑廣泛應用于臨床，主要治療腹瀉、炎癥性腸病以及便秘等。該益生菌具有多方面的優良性能，其對宿主安全，不含腸毒素、溶血毒素和細胞毒素等致病性因子，越來越多地應用于疫苗、疾病診斷及藥物研發的研究當中，在生物工程領域也是應用最為廣泛的底盤細菌之一。

白細胞介素10(interleukin?10，IL-10)是一種多細胞源、多功能的細胞因子，主要由單核巨噬細胞和T輔助細胞分泌產生，調節細胞的生長與分化，參與炎性反應和免疫反應，是公認的炎癥與免疫抑制因子。白介素10為含178個氨基酸殘基的單肽鏈糖蛋白，其中N端含有18個氨基酸信號肽序列，成熟IL-10含有160個氨基酸殘基，分子量約為18.7kD。白介素10具有多種生物學活性，可抑制單核巨噬細胞、T淋巴細胞等炎癥細胞的激活，抑制多種炎癥因子如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、G-CSF和GM-CSF的合成和分泌，增強抗炎性因子如IL-1受體拮抗劑的釋放，具有抗炎作用和免疫耐受誘導功能。臨床上IL-10被用于治療各種慢性和急性的炎癥性疾病，如過敏反應、自身免疫性疾病、類風濕性關節炎、移植排斥反應等。

Ⅰ型糖尿病是由于自身免疫缺陷和遺傳因素引起的代謝紊亂綜合征，主要是由于免疫介導胰腺β細胞的破壞而導致的胰島素絕對缺乏。I型糖尿病也稱為胰島素依賴性糖尿病，一經確診患者需要終身依賴外源胰島素治療并結合飲食控制，除此外目前尚且無其它有效療法。免疫耐受是免疫應答的特殊形式，是指機體對抗原刺激表現為特異性免疫不應答的現象。誘導免疫耐受的抗原稱為耐受原，低抗原劑量、可溶性抗原、口服或靜脈注射易誘導免疫耐受的形成。Pieter?Rottiers等人對NOD小鼠的研究顯示，在給予胰島素原持續性抗原刺激和免疫抑制因子白介素10的條件下，結合抗CD3抗體能誘導免疫耐受，抑制效應T細胞、B細胞、NK細胞等免疫活性細胞增殖，這一組合療法能保留殘留的β細胞功能，停止胰島炎進展，有效逆轉新發I型糖尿病，恢復正常血糖水平。

然而，目前并沒有一種可食用、能分泌表達人白介素10的大腸桿菌益生菌，起到將白介素10遞送至腸粘膜的作用。

發明內容

基于此，因此本發明的首要目地是提供一種分泌表達人白介素10的大腸桿菌益生菌構建方法，該方法以大腸桿菌EcN為底盤，將人白介素10基因整合到EcN基因組中，構建分泌表達人白介素10的大腸桿菌益生菌，為進一步開發I型糖尿病活菌藥物奠定基礎。

為實現上述目的，本發明的技術方案為：