[發(fā)明專利]用于溫和檢測(cè)5-羥甲基胞嘧啶的試劑盒及其檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202211440540.2
• 申請(qǐng)日: 2022-11-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN115961003A
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-04-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張臻昊;祁艷;戴雨軒;勞可靜;陳鵬;茍興春
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西安醫(yī)學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/6858
• 分類號(hào): C12Q1/6858;C12Q1/6886;C12Q1/6883;C12N15/11
• 代理公司: 北京細(xì)軟智谷知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11471
• 代理人: 劉靜榮

本發(fā)明涉及一種用于溫和檢測(cè)5hmC的試劑盒及其檢測(cè)方法，所述試劑盒包括：封閉反應(yīng)液、APOBEC脫氨基轉(zhuǎn)化液、吡啶硼烷轉(zhuǎn)化液、連接反應(yīng)液和擴(kuò)增反應(yīng)液；所述連接反應(yīng)液包括探針A和探針B。本發(fā)明首先應(yīng)用葡糖轉(zhuǎn)移酶將二磷酸尿苷?葡萄糖（UDP?Glu）修飾在5hmC的羥基上形成5gmc，保護(hù)5hmC不被后續(xù)反應(yīng)影響，之后應(yīng)用APOBEC對(duì)C和5mC進(jìn)行脫氨基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（U），再通過(guò)吡啶硼烷將5fC和5caC轉(zhuǎn)化為二氫尿嘧啶（DHU），U與DHU與A堿基互補(bǔ)配對(duì)，而5gmc依然與G配對(duì)，從而5hmC與其他堿基形成單堿基差異。采用基于連接的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）高靈敏檢測(cè)5hmC。本發(fā)明的檢測(cè)方法溫和高效，能檢測(cè)低至2fM的5hmC，特異性達(dá)到1%。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于溫和檢測(cè)5-羥甲基胞嘧啶的試劑盒及其檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

DNA甲基化作為研究最廣泛的表觀遺傳修飾，具有多種生理和病理功能,對(duì)哺乳動(dòng)物的發(fā)育極其重要。隨著5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）和TET酶的發(fā)現(xiàn)，去甲基化已成為科學(xué)研究的焦點(diǎn)。TET家族蛋白可以將5-甲基胞嘧啶（5mC）甲基上的氫氧化為羥基從而形成5hmC，5hmC可以被進(jìn)一步氧化為5-醛基胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC）,在TDG和堿基修復(fù)的作用下去除表觀修飾。5hmC不僅是主動(dòng)去甲基化過(guò)程的中間體，而且具有自身的特點(diǎn)和功能。大多數(shù)5hmC是穩(wěn)定的DNA修飾，存在高度的組織特異性，在胚胎干細(xì)胞和腦組織中富集。值得注意的是，與正常組織相比，在人類癌癥中5hmC的水平顯著減少，被認(rèn)為是診斷癌癥的一種表觀遺傳標(biāo)記物。此外，5hmC不僅在神經(jīng)發(fā)育和疾病中發(fā)揮重要作用，而且參與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)和基因表達(dá)。在神經(jīng)退行性疾病中5hmC的含量與健康對(duì)照相比有顯著差異。但由于方法限制5hmC在癌癥和神經(jīng)退行性疾病中的作用機(jī)制和生物功能仍不清楚。鑒于5hmC在表觀遺傳調(diào)控機(jī)制和包括癌癥在內(nèi)的多種疾病中早期診斷中的重要意義，急需發(fā)展簡(jiǎn)單、快速、溫和地檢測(cè)方法應(yīng)用于疾病的早期診斷和深入的機(jī)制研究。

高效液相色譜(HPLC)和質(zhì)譜(MS)法被廣泛用于測(cè)定胞嘧啶殘基中5hmC的全基因組百分比含量。但是這些方法只能檢測(cè)全基因組DNA中5hmC的總含量，不能提供任何5hmC的序列信息和位點(diǎn)分布。親和富集或化學(xué)標(biāo)記輔助測(cè)序策略可以對(duì)基因組DNA中的5hmC進(jìn)行近似定位，然而，這些富集片段通常包含幾百到上千個(gè)堿基，不能給出5hmC在DNA片段中的準(zhǔn)確位置。由于5mC和5hmC都抗亞硫酸氫鹽的脫氨反應(yīng)，因此經(jīng)典亞硫酸氫鹽的方法無(wú)法將兩者進(jìn)行區(qū)分。因此在此基礎(chǔ)上發(fā)展了氧化亞硫酸氫鹽測(cè)序(oxBS-seq)和tet輔助的亞硫酸氫鹽測(cè)序(TAB-seq)可以確定每個(gè)5hmC位點(diǎn)的位置和相對(duì)豐度。然而這些方法中的亞硫酸氫鹽處理需要高熱和高堿的條件，會(huì)造成DNA序列斷裂，不適用于少量樣品的檢測(cè)。最近發(fā)展了需化學(xué)預(yù)處理及選擇性標(biāo)記就可以直接區(qū)分5hmC、C和5mC的納米孔技術(shù)，無(wú)需對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行擴(kuò)增就可以實(shí)現(xiàn)單分子檢測(cè)，蛋白質(zhì)納米孔測(cè)序也被發(fā)展為第三代測(cè)序技術(shù)。但該方法定量分析仍是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。這些方法可以在單堿基分辨率下精確定位5hmC的位點(diǎn)，但對(duì)于少數(shù)有重要生理和病理功能的已知位點(diǎn)的5hmC檢測(cè)，測(cè)序需要極高的深度，測(cè)序技術(shù)對(duì)儀器和數(shù)據(jù)分析要求高不適合應(yīng)用于普通實(shí)驗(yàn)室和臨床研究。因此，簡(jiǎn)便、快速無(wú)亞硫酸氫鹽處理地定量分析基因組DNA中已知特定位點(diǎn)的5hmC，對(duì)進(jìn)一步揭示其生物學(xué)功能和疾病診斷具有重要意義。

近年來(lái)，應(yīng)用硼酸修飾輔助的PCR法，葡萄糖修飾輔助的連接滾環(huán)法和氧化亞硫酸氫鹽輔助的連接滾環(huán)法都無(wú)法實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單、快速地檢測(cè)特定位點(diǎn)5hmC。我們也報(bào)道了HpaII輔助連接-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，它具有高的靈敏度和特異性，仍需要氧化亞硫酸氫鹽處理，且操作復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)。在大量C和5mC的背景干擾下如何簡(jiǎn)單，快速、低損地對(duì)特定位點(diǎn)5hmC進(jìn)行精確定量仍一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。

鑒于此，申請(qǐng)此專利。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種用于溫和檢測(cè)5-羥甲基胞嘧啶的試劑盒及其檢測(cè)方法，本發(fā)明的檢測(cè)方法溫和高效，能檢測(cè)低至200aM的5hmC，特異性達(dá)到1%。