[發(fā)明專利]用于溫和檢測5-羥甲基胞嘧啶的試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202211440540.2
• 申請日: 2022-11-17
• 公開（公告）號: CN115961003A
• 公開（公告）日: 2023-04-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張臻昊;祁艷;戴雨軒;勞可靜;陳鵬;茍興春
• 申請（專利權(quán)）人: 西安醫(yī)學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12Q1/6886;C12Q1/6883;C12N15/11
• 代理公司: 北京細(xì)軟智谷知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11471
• 代理人: 劉靜榮

1.一種用于檢測5hmC的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：封閉反應(yīng)液、APOBEC脫氨基轉(zhuǎn)化液、吡啶硼烷轉(zhuǎn)化液、連接反應(yīng)液和擴(kuò)增反應(yīng)液；所述連接反應(yīng)液包括探針A、探針B；所述探針A的序列如SEQ?ID?NO:1所示；所述探針B的序列如SEQ?ID?NO:2所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中封閉反應(yīng)液包括10×cutsmart?緩沖液1μL，50×UDP-Glu?1μL，以及10U?噬菌體β-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(T4-βGT)?1μL，去離子水2μL，總體積5μL。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述APOBEC脫氨基轉(zhuǎn)化液包括APOBEC脫氨酶0.2μL，10×APOBEC脫氨基緩沖液1μL，牛血清白蛋白0.1μL，總體積1.3μL。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述吡啶硼烷轉(zhuǎn)化液包括600mM的pH=4.3的醋酸鈉溶液1μL和1M吡啶硼烷0.1μL，總體積1.1μL。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述連接反應(yīng)液包括20nM的探針A?1μL，20nM的探針B?1μL，5U的Amp連接酶0.2μL，10×Amp連接酶緩沖溶液1μL和去離子水5.8μL，總體積9μL。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括LAMP反應(yīng)混液包括10mM上游引物0.5μL，10mM?下游引物0.5μL，2.5mM的dNTP?0.8μL，8U的Bst?DNA聚合酶0.5μL，10×ThermoPol反應(yīng)緩沖溶液1μL，5M的甜菜堿2μL，50×SYBR?Green?I?0.2μL和去離子水2.5μL，總體積8μL。

7.一種采用權(quán)利要求1-6任一所述的試劑盒定量檢測基因組中5hmC的方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）封閉5hmC：準(zhǔn)備封閉反應(yīng)溶液和待測DNA樣品，將5μL封閉反應(yīng)溶液與2μL待測DNA樣品在200μL?PCR管中混合，進(jìn)行封閉反應(yīng)；

（2）脫氨轉(zhuǎn)化：步驟（1）封閉反應(yīng)結(jié)束后，將PCR管快速轉(zhuǎn)移到?PCR?管架上冷卻；將1.3μL的APOBEC脫氨基轉(zhuǎn)化液加入到封閉反應(yīng)體系，進(jìn)行脫氨反應(yīng)；

（3）吡啶硼烷轉(zhuǎn)化：將1.1μL的吡啶硼烷轉(zhuǎn)化液加入到步驟（2）脫氨轉(zhuǎn)化后的反應(yīng)溶液中，放入恒溫混勻儀中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后應(yīng)用UNlQ-10柱式通用DNA純化試劑盒對DNA純化；

（4）連接反應(yīng)：將步驟（3）純化后的DNA樣品加入到連接反應(yīng)混液中，加熱使dsDNA變性，在合適的溫度下以目標(biāo)序列為模板在連接酶的催化下連接探針A和探針B；

（5）LAMP擴(kuò)增反應(yīng)：將步驟（4）的連接產(chǎn)物取2μL加到8μL?LAMP反應(yīng)混液中；LAMP反應(yīng)的混液混勻后立即轉(zhuǎn)到StepOne?Real-Time?PCR系統(tǒng)進(jìn)行恒溫反應(yīng)，實(shí)時熒光強(qiáng)度間隔1分鐘檢測一次。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的定量檢測基因組中5hmC的方法，其特征在于，步驟（1）中，反應(yīng)條件為：在37℃下孵育2小時；步驟（2）中，反應(yīng)條件為：在2小時內(nèi)將溫度從4℃梯度升溫到50℃進(jìn)行孵育，50℃持續(xù)10分鐘；步驟（3）中，反應(yīng)條件為：恒溫混勻儀設(shè)置轉(zhuǎn)速850?rpm，37℃孵育16小時；步驟（4）中，反應(yīng)條件為：在90?℃加熱3分鐘，使dsDNA高溫變性，之后在45℃反應(yīng)15分鐘；步驟（5）中，反應(yīng)條件為：58℃反應(yīng)100分鐘。