[發明專利]一種生乳中乳蛋白定量檢測試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 202211439356.6
• 申請日: 2022-11-17
• 公開（公告）號: CN115754114A
• 公開（公告）日: 2023-03-07
• 發明（設計）人: 韓奕奕;豐東升;張維誼;馬穎清;蔣棟華;陳柔含;楊曉君;劉洋;王霞;朱春燕;鄧波;王敏;楊靜;周彬
• 申請（專利權）人: 上海市農產品質量安全中心
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N30/06
• 代理公司: 上海泰博知識產權代理有限公司 31451
• 代理人: 謝文凱

1.一種生乳的前處理試劑，其特征在于，所述試劑包括：提取劑、還原劑、烷基化試劑、酶試劑、終止劑；其中所述提取劑為碳酸氫銨；還原劑為二硫蘇糖醇；烷基化試劑為碘代乙酰胺；酶試劑為牛胰蛋白酶；終止劑為甲酸。

2.根據權利要求1所述前處理試劑，其特征在于，所述提取劑為80～120mmol/L碳酸氫銨溶液；還原劑為450～550mmol/L二硫蘇糖醇溶液；烷基化試劑為450～550mmol/L碘代乙酰胺溶液；酶試劑為80～120μg/mL牛胰蛋白酶溶液。

3.一種生乳中乳蛋白定量檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒含權利要求1所述試劑。

4.一種生乳中乳蛋白定量檢測方法，包括：

(1)稱取生乳樣品，水稀釋，渦旋搖勻，得到稀釋樣品；

(2)取稀釋樣品并加入提取劑，混勻，加入還原劑，混勻，于60℃恒溫水浴50～60min；冷卻至室溫，加入烷基化試劑，暗處靜置30～40min，加入酶試劑，混勻后置于35～39℃恒溫水浴酶解過夜，最后加入終止劑終止反應，靜置，用水定容，離心，取上清液，得到樣品溶液，然后進行高效液相色譜-串聯質譜檢測；

(3)根據乳蛋白基質混合標準工作溶液進行高效液相色譜-串聯質譜檢測，并以質量濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標繪制標準工作曲線；

(4)將樣品溶液中乳蛋白的色譜峰面積代入到標準工作曲線中，計算得到乳蛋白的含量。

5.根據權利要求4所述檢測方法，其特征在于，所述步驟(2)中稀釋樣品的濃度為4～5％；所述提取劑與稀釋樣品的體積比為0.7～0.8；還原劑與稀釋樣品的體積比為0.07～0.08；烷基化試劑與稀釋樣品的體積比為0.12～0.18；酶試劑與稀釋樣品的體積比為0.2～0.3；終止劑與稀釋樣品的體積比為0.04～0.06。

6.根據權利要求4所述檢測方法，其特征在于，所述步驟(2)、(3)中

高效液相色譜-串聯質譜參數均為：

液相色譜條件：色譜柱：C8柱；進樣體積：10μL；柱溫：40℃；流速：0.3mL/min；流動相為流動相A：0.1％甲酸水溶液，流動相B：0.1％甲酸乙腈溶液；洗脫梯度程序：0～0.5min，5％B；0.5～4.5min，70％B；4.5～5.5min，70％B；5.5～6.0min，5％B；6.0～8.0min，5％B；

質譜條件：離子源：電噴霧離子源；電離模式：正離子掃描；監測模式：多重反應監測MRM；干燥氣溫度200℃；干燥氣流量14L/min；霧化氣壓力20psi；鞘氣溫度300℃；

鞘氣流量11L/min；毛細管電壓4.00kV；噴嘴電壓300V。

7.根據權利要求4所述檢測方法，其特征在于，所述步驟(3)中高效液相色譜-串聯質譜檢測的目標物是乳鐵蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白中經牛胰蛋白酶酶解后的特征性肽段，其氨基酸序列分別為：乳鐵蛋白：SFQLFGSPPGQR、α-乳白蛋白：VGINYWLAHK和β-乳球蛋白：TPEVDDEALEK。

8.根據權利要求4所述檢測方法，其特征在于，所述步驟(3)中基質混合標準工作溶液具體為：將馬乳基質中添加乳鐵蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白標準溶液，按樣品前處理過程，進行提取，還原，烷基化，酶切處理，最終得到基質混合標準工作溶液。

9.根據權利要求4所述檢測方法，其特征在于，所述步驟(3)中乳蛋白為乳鐵蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白中的一種或幾種；所述標準工作曲線為：

乳鐵蛋白的標準工作曲線：y＝53747.51702x-21822.47985，R²＝0.99922；

α-乳白蛋白的標準工作曲線：y＝48652.34122x-9525.06444，R²＝0.99973；

β-乳球蛋白的標準工作曲線：y＝100676.5731x-4898.46264，R²＝0.99902。

10.一種權利要求3所述生乳中乳蛋白定量檢測試劑盒的應用，其特征在于，所述試劑盒同時檢測生乳中乳鐵蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白一種或幾種的含量。