[發明專利]一種胰島星狀細胞向胰島β樣細胞分化的誘導方法

在審

• 申請號: 202211433739.2
• 申請日: 2022-11-16
• 公開（公告）號: CN116179469A
• 公開（公告）日: 2023-05-30
• 發明（設計）人: 周云婷;孫子林;孫博;徐偉;倪成銘
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;A61K35/39;A61P3/10
• 代理公司: 北京同輝知識產權代理事務所(普通合伙) 11357
• 代理人: 張恩慧

本發明公開一種胰島星狀細胞向胰島β樣細胞分化的誘導方法，所述誘導方法包括以下步驟：準備貼壁細胞；對貼壁細胞進行重組激活素?A、堿性成纖維細胞生長因子處理，誘導細胞內胚層化；對內胚層化細胞進行視黃酸、表皮生長因子和ITS細胞培養添加物處理，誘導細胞胰腺特異化；對胰腺特異化細胞進行胰高血糖素樣肽1受體的激動劑、骨形態發生蛋白4和煙酰胺處理，誘導胰島星狀細胞分化細胞形成并成熟化；對胰島類β樣細胞表型鑒定。本發明誘導方法通過分步誘導，不同誘導階段添加不同誘導分化激活劑，可有效促進胰島星狀細胞向圓形類胰島細胞簇分化，達到高效誘導胰島星狀細胞向胰島β樣細胞分化技術。

技術領域

本發明涉及生物醫學技術領域，具體是一種胰島星狀細胞向胰島β樣細胞分化的誘導方法。

背景技術

糖尿病是一組因體內胰島素絕對或相分泌不足引起血糖升高而致的一系列臨床綜合癥。雖然糖尿病病因學和發病機制研究道路漫漫，但大量胰島β細胞衰竭是1型糖尿病及終末期2型糖尿病發生發展的核心及最終結果。因此，恢復功能性β細胞總量仍是有效防治糖尿病的關鍵路徑。然而，多能干細胞存在供體受限且免疫排斥風險，胰腺內細胞的α和δ細胞為分化終末細胞，胰腺導管細胞和腺泡細胞位于胰島外，一定程度制約它們未來的臨床應用前景。因此，能否尋找到并針對胰島內組織特異性的干細胞類型，通過激活胰島內成體內源性干細胞與調控干細胞分化微環境，建立促進β細胞再生修復的新策略，是糖尿病學界十分期待的答案。

新近我們的研究結果發現：胰島星狀細胞與既往報道的多種胰腺干/祖細胞類型之間有眾多相似生物學表型；胰島星狀細胞與骨髓間充質干細胞共享多種干細胞標志分子，并表達多種成體干/祖細胞標志分子，且其具有干性；胰島星狀細胞具有較強的增殖和多向分化能力，在體外可誘導分化為成骨、成脂細胞。這些結果提示胰島星狀細胞可能是胰島內組織特異性的干/祖細胞類型，但是目前胰島星狀細胞是否能向β樣細胞分化，目前并無報道。

已知組織干細胞譜系定向分化命運是細胞感知物理化學刺激因子，在多時空網絡下的精準規律模式調控過程。胰腺的發生發育需經歷祖細胞內胚層化-胰腺特異化-胰島形成并成熟化的逐步分化模式。研究表明，通過分步誘導方案，干細胞可表達更多的干細胞標志物，具有更有的分化潛力。因此，現提出一種胰島星狀細胞向胰島β樣細胞分化的誘導方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種胰島星狀細胞向胰島β樣細胞分化的誘導方法，通過分步誘導，在不同誘導階段添加不同誘導分化激活劑，可有效促進胰島星狀細胞向圓形類胰島細胞簇分化，達到高效誘導胰島星狀細胞向胰島β樣細胞分化技術，構建一種誘導胰島星狀細胞向胰島β樣細胞分化的新方法。

本發明的目的可以通過以下技術方案實現：

一種胰島星狀細胞向胰島β樣細胞分化的誘導方法，所述誘導方法包括以下步驟：

步驟一：準備貼壁細胞。

步驟二：對貼壁細胞進行重組激活素-A、堿性成纖維細胞生長因子處理，誘導細胞內胚層化。

步驟三：對內胚層化細胞進行視黃酸、表皮生長因子和ITS細胞培養添加物處理，誘導細胞胰腺特異化。

步驟四：對胰腺特異化細胞進行胰高血糖素樣肽1受體的激動劑、BMP4、骨形態發生蛋白4和煙酰胺處理，誘導貼壁細胞分化形成并成熟化。

步驟五:對胰島類β樣細胞表型鑒定。

進一步的，所述步驟一將貼壁細胞復蘇后離心，利用細胞培養基重懸，接種于細胞培養板上，接種后的細胞在37℃的溫度下培養。

進一步的，所述步驟二將經過培養后的貼壁細胞用PBS清洗兩次，使用培養基I培養，誘導細胞內胚層方向分化。

所述培養基I的成分為：11.1mM?glucose?DMEM/F12細胞培養基、重組激活素-A和堿性成纖維細胞生長因子。