[發(fā)明專利]一種胰島星狀細(xì)胞向胰島β樣細(xì)胞分化的誘導(dǎo)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202211433739.2
• 申請(qǐng)日: 2022-11-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN116179469A
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-05-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周云婷;孫子林;孫博;徐偉;倪成銘
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071;A61K35/39;A61P3/10
• 代理公司: 北京同輝知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11357
• 代理人: 張恩慧

1.一種胰島星狀細(xì)胞向胰島β樣細(xì)胞分化的誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)方法包括以下步驟：

步驟一：準(zhǔn)備貼壁細(xì)胞；

步驟二：對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行重組激活素-A、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子處理，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)胚層化；

步驟三：對(duì)內(nèi)胚層化細(xì)胞進(jìn)行視黃酸、表皮生長(zhǎng)因子和ITS細(xì)胞培養(yǎng)添加物處理，誘導(dǎo)細(xì)胞胰腺特異化；

步驟四：對(duì)胰腺特異化細(xì)胞進(jìn)行胰高血糖素樣肽1受體的激動(dòng)劑骨形態(tài)發(fā)生蛋白4、和煙酰胺處理，誘導(dǎo)貼壁細(xì)胞分化形成并成熟化；

步驟五:對(duì)胰島類β樣細(xì)胞表型鑒定。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種胰島星狀細(xì)胞向胰島β樣細(xì)胞分化的誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述步驟一將貼壁細(xì)胞復(fù)蘇后離心，利用細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，接種于細(xì)胞培養(yǎng)板上，接種后的細(xì)胞在37℃的溫度下培養(yǎng)。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種胰島星狀細(xì)胞向胰島β樣細(xì)胞分化的誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述步驟二將經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后的貼壁細(xì)胞用PBS清洗兩次，使用培養(yǎng)基I培養(yǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)胚層方向分化；

所述培養(yǎng)基I的成分為：11.1mM?glucose?DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基、重組激活素-A和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種胰島星狀細(xì)胞向胰島β樣細(xì)胞分化的誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述步驟三經(jīng)過(guò)步驟二處理后的細(xì)胞使用PBS進(jìn)行清洗，并更換為培養(yǎng)基II，繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后誘導(dǎo)細(xì)胞向胰腺特異化方向分化；

所述培養(yǎng)基II的成分為：11.1mM?glucose?DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基，胎牛血清，ITS細(xì)胞培養(yǎng)添加物、視黃酸和表皮生長(zhǎng)因子。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種胰島星狀細(xì)胞向胰島β樣細(xì)胞分化的誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述步驟四經(jīng)過(guò)步驟三處理后使用PBS清洗細(xì)胞，并更換為培養(yǎng)基III，繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間后誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)形成并成熟；

所述培養(yǎng)基III的成分為：11.1mM?glucose?DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、胰高血糖素樣肽1受體的激動(dòng)劑、骨形態(tài)發(fā)生蛋白4、煙酰胺。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種胰島星狀細(xì)胞向胰島β樣細(xì)胞分化的誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述步驟五對(duì)胰島類β樣細(xì)胞表型鑒定方法包括：

1)經(jīng)DTZ染色測(cè)定分化成功細(xì)胞胰島雙硫腙染色；

2)經(jīng)免疫熒光染色鑒定分化細(xì)胞呈C肽陽(yáng)性及C肽陽(yáng)性胰島星狀細(xì)胞顯示與胰島素存在共定位，顯示貼壁細(xì)胞成功誘導(dǎo)成胰島類β樣細(xì)胞；

3)ELISA免疫定量測(cè)定細(xì)胞分化成功后細(xì)胞胰島素含量，分化成功后細(xì)胞胰島素含量顯著增加，則貼壁細(xì)胞來(lái)源的胰島類β樣細(xì)胞內(nèi)胰島素含量顯著增加。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種胰島星狀細(xì)胞向胰島β樣細(xì)胞分化的誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述貼壁細(xì)胞包括胰島星狀細(xì)胞以及凍存復(fù)蘇后的細(xì)胞或傳代消化后的細(xì)胞。

8.一種用于治療糖尿病的藥物，包括：重組激活素-A、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、視黃酸、表皮生長(zhǎng)因子、胰高血糖素樣肽1受體的激動(dòng)劑、骨形態(tài)發(fā)生蛋白4和煙酰胺。