[發明專利]一種外泌體的分離提取方法

在審

• 申請號: 202211430834.7
• 申請日: 2022-11-15
• 公開（公告）號: CN115678840A
• 公開（公告）日: 2023-02-03
• 發明（設計）人: 王鑫;王瑞莉;張忠旗;翟江華;李元
• 申請（專利權）人: 陜西慧康生物科技有限責任公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12N5/071
• 代理公司: 西安永生專利代理有限責任公司 61201
• 代理人: 高雪霞

本發明公開了一種外泌體的分離提取方法，該方法是將含外泌體的液體樣品用孔徑0.45nm的超濾膜進行過濾，所得濾液過多聚賴氨酸修飾的陽離子樹脂柱，外泌體被多聚賴氨酸吸附，其他雜蛋白、脂類、鹽從柱子穿過，通過洗脫液進行洗脫得到粗提的外泌體溶液；粗提的外泌體溶液再經過CD63?CNBr?Sepharose 4B等層析柱精提，最后用100KD孔徑的超濾膜超濾，獲得純度95％以上的外泌體。本發明方法無需超速離心，即可實現從培養上清和乳品等中提取高純度外泌體，整個提取過程操作簡單，穩定，容易操作，提取的外泌體結構完整、純度高、回收率高，并且不需要復雜的儀器就能完成外泌體的提取。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種外泌體的分離提取方法。

背景技術

外泌體(Exosomes)是細胞所分泌的直徑為30～150nm，密度在1.13～1.21g/mL的雙層磷脂囊泡，通常情況下是以胞吐形式釋放到細胞外環境。其表面含有和功能相關的蛋白質和脂質成分，其膜表面表達特異性的蛋白質如CD9、CD63、CD81、TSC101和HSP70等，內部包裹了供體來源的蛋白質、核酸等活性物質。當外泌體和靶細胞接觸后，其攜帶的生物分子以胞吞的形式被接收，在靶細胞中釋放出來并發揮作用。近年來，隨著對外泌體研究的進一步加深，發現不同組織細胞來源的外泌體呈現組織細胞的特異性，能夠攜帶來源細胞的生物活性蛋白質、脂質、核酸等；在機體生理和病理狀態下，外泌體內含的物質會隨著細胞環境的變化而發生變化，因此，外泌體診斷在臨床應用中越來越被重視。

外泌體能夠在細胞間穿梭，有利于細胞間物質和信息的交換，通過裝載外來藥物來改變受體細胞的功能和狀態，實現靶向治療的目的。外泌體作為裝載的工具，能夠攜帶各種類型的藥物，到達體內的各個系統，在神經系統疾病中，藥物很難通過血腦屏障進入到靶細胞發揮作用，而外泌體可以通過實現對疾病的治療。

外泌體的提取主要有以下幾種方式：(1)超速離心法，是目前的金標準方法，此種方法采用低速離心高速離心交替進行分離外泌體，純度高，但綜合產量不高；(2)密度梯度離心法，使外泌體聚集在特定的密度階層，純度高，綜合產量較好，但操作繁瑣；(3)超濾離心法，利用不同截留相對分子質量的超濾膜對樣品進行分離，此方法比較粗糙，操作簡單；(4)磁珠免疫法，用包被抗標記物的磁珠分離外泌體，這種方法特異性較高，標記物標記的抗體較難拿到，有嚴格的要求。現在雖然有不同的外泌體提取方法，但均無法解決規模化提取的問題，常用的超速離心法一次離心的液體量有限；超濾法可以上規模但純度有限；凝膠柱可以達到純化效果但一次上樣量有限。這些提取方法各有優缺點，多數方法只能做到小批量提取，能夠做到大規模提取的，目前還沒有一種很有效的方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種可實現大規模高純度提取外泌體的方法，整個操作過程不需要離心機，操作過程簡單，只經過一次超濾膜過濾，過一次凝膠、一次色譜柱就可實現大規模提取，且整個實驗過程中沒有使用化學性質強的試劑和劇烈的反應，過程溫和沒有造成對所提外泌體結構性質的影響，提取的外泌體結構完整、性質穩定，能夠實現對各種外泌體的提取。

針對上述目的，本發明采用的外泌體的分離提取方法包括下述步驟組成：

1、將含外泌體的液體樣品用孔徑0.45nm的超濾膜進行過濾，收集濾液；

2、將步驟1收集的濾液穿過多聚賴氨酸修飾的陽離子樹脂柱，再用洗脫液洗脫樹脂柱，收集粗提的外泌體溶液；其中，所述多聚賴氨酸修飾的陽離子樹脂是將含-COOH或-NH₂的陽離子樹脂直接和多聚賴氨酸連接獲得或者將含-OH或-COOH或-NH₂的陽離子樹脂通過Linker和多聚賴氨酸連接獲得；所述洗脫液為3～6mol/L尿素溶液、3～6mol/L鹽酸胍溶液、3～6mol/L異硫氰酸胍溶液中任意一種；