[發明專利]一種外泌體的分離提取方法

在審

• 申請號: 202211430834.7
• 申請日: 2022-11-15
• 公開（公告）號: CN115678840A
• 公開（公告）日: 2023-02-03
• 發明（設計）人: 王鑫;王瑞莉;張忠旗;翟江華;李元
• 申請（專利權）人: 陜西慧康生物科技有限責任公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12N5/071
• 代理公司: 西安永生專利代理有限責任公司 61201
• 代理人: 高雪霞

1.一種外泌體的分離提取方法，其特征在于，所述方法包括下述步驟組成：

(1)將含外泌體的液體樣品用孔徑0.45nm的超濾膜進行過濾，收集濾液；

(2)將步驟(1)收集的濾液穿過多聚賴氨酸修飾的陽離子樹脂柱，再用洗脫液洗脫樹脂柱，收集粗提的外泌體溶液；

所述多聚賴氨酸修飾的陽離子樹脂是將含-COOH或-NH₂的陽離子樹脂直接和多聚賴氨酸連接獲得或者將含-OH或-COOH或-NH₂的陽離子樹脂通過Linker和多聚賴氨酸連接獲得；

所述洗脫液為3～6mol/L尿素溶液、3～6mol/L鹽酸胍溶液、3～6mol/L異硫氰酸胍溶液中任意一種；

(3)將粗提的外泌體溶液穿過CD63-CNBr-Sepharose 4B層析柱或CD81-CNBr-Sepharose 4B層析柱或CD9-CNBr-Sepharose 4B層析柱，再用鹽酸-甘氨酸洗脫層析柱，對外泌體進行進一步的精提；

(4)將精提的外泌體溶液和PBS緩沖液等體積混合，然后用100KD孔徑的超濾膜超濾，此過程重復3～5次，得到純度95％以上的外泌體。

2.根據權利要求1所述的外泌體的分離提取方法，其特征在于，步驟(1)中，所述含外泌體的液體樣品為牛奶、羊奶、人乳、細胞培養上清、尿液、血清中任意一種。

3.根據權利要求1所述的外泌體的分離提取方法，其特征在于，步驟(2)中，先用1.5～2倍柱體積的20mmol/L pH＝7.35的PBS緩沖液平衡樹脂柱，待電導及紫外吸收值穩定后，將步驟(1)收集的濾液進行上樣，上樣量為1.5～2個柱體積，上樣速度為0.5～3mL/分鐘，上樣結束后靜置5～10分鐘，用1～2個柱體積的20mmol/L pH＝7.35的PBS緩沖液再次平衡樹脂柱；基線穩定后，用1個柱體積的洗脫液洗脫樹脂柱，然后靜置5～10分鐘，繼續用洗脫液洗脫樹脂柱，收集粗提的外泌體溶液。

4.根據權利要求1所述的外泌體的分離提取方法，其特征在于，所述含-COOH的陽離子樹脂為羧基化硅膠、羧基化瓊脂糖、羧基化葡聚糖中任意一種；所述含-NH₂的陽離子樹脂為氨基化硅膠、氨基化瓊脂糖、氨基化葡聚糖中任意一種；所述含-OH的陽離子樹脂為羥基化硅膠、羥基化瓊脂糖、羥基化葡聚糖中任意一種。

5.根據權利要求4所述的外泌體的分離提取方法，其特征在于，所述多聚賴氨酸修飾的陽離子樹脂是在縮合劑、添加劑的作用下，將含-COOH的陽離子樹脂與多聚賴氨酸的-NH₂通過縮合反應或含-NH₂的陽離子樹脂與多聚賴氨酸的-COOH通過縮合反應獲得。

6.根據權利要求5所述的外泌體的分離提取方法，其特征在于，所述多聚賴氨酸修飾的陽離子樹脂是：在縮合劑、添加劑的作用下，將含-OH或-NH₂的陽離子樹脂與兩端均為-COOH或一端為-COOH、另一端為-OH或-NH₂的Linker上一端的-COOH進行縮合反應后，再將多聚賴氨酸的-NH₂與Linker上另一端的-COOH進行縮合反應或多聚賴氨酸的-COOH與Linker上另一端的-OH或-NH₂進行縮合反應，得到多聚賴氨酸修飾的陽離子樹脂；

或者所述多聚賴氨酸修飾的陽離子樹脂是：在縮合劑、添加劑的作用下，將含-COOH的陽離子樹脂與兩端均為-OH或兩端均為NH₂或一端為-OH、另一端為-NH₂的Linker上一端的-OH或NH₂進行縮合反應后，再將多聚賴氨酸的-COOH與Linker上另一端的-OH或-NH₂進行縮合反應，得到多聚賴氨酸修飾的陽離子樹脂。