[發(fā)明專(zhuān)利]NOTCH2NLC基因GGC重復(fù)擴(kuò)增突變轉(zhuǎn)基因小鼠及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202211430105.1
• 申請(qǐng)日: 2022-11-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN115851833B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 潘永誠(chéng);劉瓊;唐北沙
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/85
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/85;C12N15/90;C12N15/89;C12N15/113;C12N15/55;A01K67/027
• 代理公司: 北京知果之信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11541
• 代理人: 蘇利

1.NOTCH2NLC基因GGC重復(fù)擴(kuò)增突變轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1，構(gòu)建帶有LoxP序列并定點(diǎn)敲入NOTCH2NLC基因的小鼠：在小鼠體內(nèi)的Rosa26基因位點(diǎn)，定點(diǎn)插入CAG-Loxp-Stop-Loxp-NOTCH2NLC-(GGC)n-3tag-WPRE-polyA表達(dá)框，繁育并鑒定出F0代陽(yáng)性小鼠；所述n為自然數(shù)，且n≥60；

S2，將F0代陽(yáng)性小鼠與野生型小鼠交配并繁殖，獲得F1代小鼠，鑒定出陽(yáng)性F1代雜合子條件性轉(zhuǎn)基因小鼠；

S3，將陽(yáng)性F1代雜合子條件性轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠回交m代，其中，m為自然數(shù)，且m≥2，得到F_(1+m)代雜合子條件性轉(zhuǎn)基因小鼠；將F_(1+m)代雜合子條件性轉(zhuǎn)基因小鼠之間交配并繁殖，得到純合子條件性轉(zhuǎn)基因小鼠；

S4，將F_(1+m)代雜合子條件性轉(zhuǎn)基因小鼠或純合子條件性轉(zhuǎn)基因小鼠與cre工具小鼠雜交，獲得轉(zhuǎn)基因小鼠。

2.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S1中，所述n為98。

3.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S1中，采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)定點(diǎn)插入所述表達(dá)框。

4.如權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S1中，采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)定點(diǎn)插入所述表達(dá)框的具體方法為：

1)、針對(duì)Rosa26位點(diǎn)設(shè)計(jì)gRNA靶序列，所述gRNA的基因序列為：GGGGACACACTAAGGGAGCTTGG；

2)、將外源NOTCH2NLC-(GGC)n-3tag通過(guò)AgeI和EcorV酶切，連接至donor質(zhì)粒上，獲得CAG-Loxp-Stop-Loxp-NOTCH2NLC-(GGC)n-3tag-WPRE-polyA重組donor質(zhì)粒；

3)、將Cas9?mRNA、gRNA及重組donor質(zhì)粒進(jìn)行小鼠受精卵注射，然后將注射后的小鼠受精卵移植到假孕母鼠中，孕育的小鼠為F0代小鼠。

5.如權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，將獲得的重組donor質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入STBL3大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增時(shí)，在25-30℃培養(yǎng)46-50小時(shí)。

6.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S1中，通過(guò)長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增和電泳的方法鑒定出F0代陽(yáng)性小鼠；

所述長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增時(shí)的引物為：

長(zhǎng)片段PCR?5′同源臂鑒定引物信息：

正向引物I：5′-GCCGGGCCTCGTCGTCTG-3′

反向引物II：5′-TGAGGGCAATCTGGGAAGGTT-3′；

長(zhǎng)片段PCR?3′同源臂鑒定引物信息：

正向引物III：5′-GGGGGAGGGGAGTGTTGC-3′

反向引物IV：5′-TTCTTCCTGCCTGCCTTCTGTGAC-3′；

電泳后，5端臂產(chǎn)生泳道條帶大小為3.4kb和5.1kb，且3端臂產(chǎn)生泳道條帶大小為6.5kb和3.6kb時(shí)，對(duì)應(yīng)的待測(cè)小鼠即為F0代陽(yáng)性小鼠。

7.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S2中，通過(guò)PCR擴(kuò)增和測(cè)序的方法，或通過(guò)PCR擴(kuò)增和電泳的方法鑒定出陽(yáng)性F1代雜合子條件性轉(zhuǎn)基因小鼠；

所述PCR擴(kuò)增時(shí)的引物為：

鑒定引物I：TAAAGGCCACTCAATGCTCACTAA

鑒定引物II：TCAGATTCTTTTATAGGGGACACA；

鑒定引物III:GCGCAGGATCCTACCCATAC

鑒定引物IV:AAAGTCCCGGAAAGGAGCTG；

電泳后，同時(shí)產(chǎn)生967bp和604bp的泳道條帶時(shí)，對(duì)應(yīng)的待測(cè)小鼠即為陽(yáng)性F1代雜合子條件性轉(zhuǎn)基因小鼠。