[發(fā)明專利]NOTCH2NLC基因GGC重復(fù)擴增突變轉(zhuǎn)基因小鼠及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202211430105.1
• 申請日: 2022-11-15
• 公開（公告）號: CN115851833B
• 公開（公告）日: 2023-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 潘永誠;劉瓊;唐北沙
• 申請（專利權(quán)）人: 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;C12N15/89;C12N15/113;C12N15/55;A01K67/027
• 代理公司: 北京知果之信知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11541
• 代理人: 蘇利

本申請公開了NOTCH2NLC基因GGC重復(fù)擴增突變轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法，包括以下步驟：構(gòu)建帶有LoxP序列并定點敲入NOTCH2NLC基因的F0代陽性小鼠；將F0代陽性小鼠與野生型小鼠交配并繁殖，鑒定出陽性F1代雜合子條件性轉(zhuǎn)基因小鼠；將陽性F1代雜合子條件性轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠回交m代，得到Fsubgt;(1+m)/subgt;代雜合子條件性轉(zhuǎn)基因小鼠；將Fsubgt;(1+m)/subgt;代雜合子條件性轉(zhuǎn)基因小鼠之間交配并繁殖，得到純合子條件性轉(zhuǎn)基因小鼠；將Fsubgt;(1+m)/subgt;代雜合子條件性轉(zhuǎn)基因小鼠或純合子條件性轉(zhuǎn)基因小鼠與cre工具小鼠雜交，獲得轉(zhuǎn)基因小鼠。本申請解決了相關(guān)技術(shù)中的如何構(gòu)建穩(wěn)定的神經(jīng)元核內(nèi)包涵體病動物模型的技術(shù)問題。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于動物模型構(gòu)建的生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及NOTCH2NLC基因GGC重復(fù)擴增突變轉(zhuǎn)基因小鼠及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

神經(jīng)元核內(nèi)包涵體病(Neuronal?Intranuclear?Inclusion?Disease，NIID)是一種以廣泛存在的神經(jīng)元核內(nèi)包涵體為特征的致死性神經(jīng)退行性疾病。NIID的臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，主要表現(xiàn)為肌無力和癡呆，此外還可見帕金森樣癥狀、小腦共濟失調(diào)、震顫、發(fā)作性的意識障礙、感覺障礙和運動障礙等癥狀。2019年NOTCH2NLC基因GGC重復(fù)擴增被報道為NIID致病基因突變后，越來越多的NIID病例得到確診。隨后，各國科學(xué)家陸續(xù)在亞洲人群原發(fā)性震顫、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化、阿爾茨海默病、額顳葉癡呆、腦白質(zhì)病變和多系統(tǒng)萎縮等疾病部分患者中也檢測到相同基因突變，而在歐洲人群相應(yīng)疾病中沒有或很少檢測到該突變，這表明該基因突變可能在亞洲人群神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。然而，NIID發(fā)病的具體分子機制尚無任何報道，亟待開展相關(guān)研究。

人類疾病的動物模型，是生物醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中所建立的具有人類疾病模似性表現(xiàn)的動物實驗對象和材料，是現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究中的一個極為重要的實驗對象和工具，有助于更方便、更有效地認識人類疾病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律和研究防治措施。實驗小鼠由于容易飼養(yǎng)、繁殖率高、遺傳上有較高的純和度、世代周期短、個體間差異小、代謝類型、生理病理與人類接近、有高級神經(jīng)活動等特點，成為現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中應(yīng)用最廣泛的模式動物。

2021年，法國科學(xué)家通過注射腺相關(guān)病毒過表達NOTCH2NLC基因GGC重復(fù)擴增，證明該模型能夠部分模擬患者行為及病理表型；然而，通過注射腺相關(guān)病毒過表達方法建立的小鼠模型不能夠穩(wěn)定的向下一代傳遞該突變，從而導(dǎo)致該小鼠模型在探索疾病發(fā)病機制、開發(fā)治療藥物等方面的應(yīng)用受到諸多限制。

針對相關(guān)技術(shù)中的如何構(gòu)建穩(wěn)定的神經(jīng)元核內(nèi)包涵體病動物模型的問題，目前尚未提出有效的解決方案。

發(fā)明內(nèi)容

本申請的主要目的在于提供NOTCH2NLC基因GGC重復(fù)擴增突變轉(zhuǎn)基因小鼠及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，以解決構(gòu)建穩(wěn)定的神經(jīng)元核內(nèi)包涵體病動物模型的問題。本申請通過CRISPR/Cas9、胚胎干細胞打靶、顯微注射等技術(shù)建立了世界上首個攜帶NOTCH2NLC基因GGC重復(fù)擴增突變的轉(zhuǎn)基因小鼠，該轉(zhuǎn)基因小鼠模型能夠穩(wěn)定的將NOTCH2NLC基因GGC重復(fù)擴增突變進行代際傳遞，能夠模擬患者的各種病理特征及臨床表型。該小鼠模型將為NOTCH2NLC基因GGC重復(fù)擴增突變相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展機制、藥物篩選及療效評價提供重要的動物模型。

為了實現(xiàn)上述目的，第一方面，本申請?zhí)峁㎞OTCH2NLC基因GGC重復(fù)擴增突變轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

S1，構(gòu)建帶有LoxP序列并定點敲入NOTCH2NLC基因的小鼠：在小鼠體內(nèi)的Rosa26基因位點，定點插入CAG-Loxp-Stop-Loxp-NOTCH2NLC-(GGC)n-3tag-WPRE-polyA表達框，繁育并鑒定出F0代陽性小鼠；所述n為自然數(shù)，且n≥60；

S2，將F0代陽性小鼠與野生型小鼠交配并繁殖，獲得F1代小鼠，鑒定出陽性F1代雜合子條件性轉(zhuǎn)基因小鼠；