[發明專利]靶向敲除人TMEM121基因的sgRNA，構建該基因缺失細胞株的方法及應用

有效

• 申請號: 202211429717.9
• 申請日: 2022-11-15
• 公開（公告）號: CN115896112B
• 公開（公告）日: 2023-08-15
• 發明（設計）人: 周軍媚;姚峰;李婉蓮
• 申請（專利權）人: 桂林醫學院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/12;C12N9/22;C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 北京律譜知識產權代理有限公司 11457
• 代理人: 黃莉

1.一種靶向敲除人TMEM121基因的sgRNA，其特征在于，為Sequence2所示的序列TGTAGCAGTAGAAGAAGGTG。

2.一種Cas9重組質粒，其特征在于，含有權利要求1所述的靶向敲除人TMEM121基因的sgRNA。

3.權利要求2所述Cas9重組質粒的構建方法，其特征在于，包括：

1）分別在sgRNA兩端加酶切位點，在每條sgRNA序列的正義鏈的5’端添加CACC，反義鏈的5’端添加AAAC，從而形成與pX459質粒經Fast?Digest?BbsI酶切后互補的粘性末端，如果正義鏈的5’端第一個堿基不是G，則在5’端CACC后面增加一個G，相應的反義鏈3’端再增加一個C；合成sgRNA的正反鏈，進行sgRNA正反鏈退火成雙鏈DNA；

2）選擇pX459質粒作為Cas9載體，包含cas9及Puromycin抗性基因表達框，使用限制性內切酶BbsI酶切，酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，使用QIAGEN膠回收試劑盒，按說明書進行操作回收線性化的pX459質粒作為載體；

3）PCR儀進行退火反應，設置退火條件：95℃，5min，然后梯度降溫，-1℃/1min，降溫至25℃；

4）將雙鏈sgRNA與線性化的pX459質粒載體連接，轉化，提取重組質粒，轉染細胞，利用有限稀釋法構建單克隆細胞敲除株，獲得靶向敲除人TMEM121基因的Cas9重組質粒。

4.一種試劑盒，其特征在于，包含權利要求1所述的靶向敲除人TMEM121基因的sgRNA，和/或權利要求2所述的Cas9重組質粒。

5.權利要求1所述的靶向敲除人TMEM121基因的sgRNA或權利要求2所述的Cas9重組質粒在制備治療肝癌的藥物中的用途。

6.一種TMEM121基因缺失的細胞株的制備方法，其特征在于，包括：

將權利要求2所述Cas9重組質粒通過轉染HEK293T細胞，有限稀釋法傳代篩選，獲得TMEM121基因缺失的細胞株。