[發明專利]靶向敲除人TMEM121基因的sgRNA，構建該基因缺失細胞株的方法及應用

有效

• 申請號: 202211429717.9
• 申請日: 2022-11-15
• 公開（公告）號: CN115896112B
• 公開（公告）日: 2023-08-15
• 發明（設計）人: 周軍媚;姚峰;李婉蓮
• 申請（專利權）人: 桂林醫學院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/12;C12N9/22;C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 北京律譜知識產權代理有限公司 11457
• 代理人: 黃莉

本發明公開了靶向敲除人TMEM121基因的sgRNA、構建TMEM121基因缺失細胞株的方法及應用，屬于生物醫藥技術領域。通過Cas9系統構建pX459?TMEM121重組質粒，將Cas9重組質粒轉染HEK293T細胞，通過Puromycin進行篩選、有限稀釋法結合HEK293T篩選，獲得穩定的TMEM121基因敲除的細胞株HEK293T細胞和Huh7細胞。DNA檢測顯示，基因敲除的細胞株TMEM121基因出現缺失。另外，TMEM121基因敲除的細胞株遷移和侵襲能力明顯下降。結果表明，利用Cas9系統成功敲除TMEM121基因后，可阻礙肝癌細胞的惡性轉化。

技術領域

本發明屬于生物醫藥技術領域，具體是一種靶向敲除人TMEM121基因的sgRNA，構建TMEM121基因缺失細胞株的方法及應用。

背景技術

TMEM121基因位于人第14號染色體上(14q32.33)，含有2個外顯子，轉錄1.5kb的mRNA，編碼319個氨基酸殘基，在成人組織中的心臟、肝臟、骨骼肌、胰腺中均有表達。TMEM121蛋白是一個跨膜蛋白，具有6個跨膜區，沒有結構域。目前對TMEM121的功能研究尚少。僅有數篇文獻報道：TMEM121基因抑制宮頸癌細胞的轉移；TMEM121與前列腺患者的無復發生存率負相關，可能在前列腺癌發生過程中起致癌作用；在皮膚愈傷組織中，TMEM121表達上調，且與內皮細胞標記蛋白CD31共定位，影響人的原代內皮細胞的遷移和增殖，可能與真皮組織脈管系統的再生有關。但是TMEM121在肝癌的發生發展中的作用尚未報道。肝癌位居世界惡性腫瘤發病率的第三位，死亡率的第二位。晚期肝癌患者五年生存率低于30％，而目前仍缺乏有效的治療方案。因此，深入研究肝癌發生發展的分子機制，對探索肝癌診治的新靶點、促進精準醫療具有重要意義。我們的研究發現TMEM121在肝癌細胞中過表達，有促進肝癌細胞增殖及遷移和侵襲的作用。在裸鼠皮下成瘤的模型中，TMEM121過表達促進腫瘤的發生。在小鼠肝臟再生模型中，TMEM121與周期因子cyclinD1的表達圖譜相似，其機理尚不清楚。

現有技術的研究方向以及缺陷包括：

(1)Cas9系統是一種后天免疫防御系統，用以保護細菌或古細菌免受外來質粒或噬菌體的侵入，這類細菌或古細菌基因組的序列能表達與入侵者基因組序列相識別的RNA，在相關酶(CAS9)的作用下切割外源基因組DNA，達到抵制入侵的目的，經過人為改造后，Cas9系統可以實現在真核細胞中高度靈活且特異的基因組編輯，是目前基因組編輯領域最受歡迎的新一代基因組編輯技術，Cas9基因編輯系統靶向位點選擇靈活、效率高、載體構建方法簡單，是近年來基因編輯領域的重大研究突破和研究熱點，目前該技術已被用于構建各類基因敲除細胞系和基因敲除動物模型，然而還未與靶向敲除人TMEM121基因的sgRNA，構建TMEM121基因缺失細胞株的研究進行有機結合。

(2)有限稀釋法挑選單克隆細胞的原理是利用梯度稀釋，當稀釋梯度足夠高時，可以獲得的單一細胞，培養增殖之后能獲得背景單一的細胞株。有限稀釋法的操作簡單，容易得到單克隆細胞株。一般情況下，為了最大可能性的獲得有敲除效應的sgRNA,一般研究者都會設計至少3條sgRNA，工作量比較大。

(3)腫瘤研究中最常用的實驗方法利用Transwell培養小室研究腫瘤細胞的遷移與侵襲實驗。Transwell培養小室外形為一個可放入孔板內的小杯子，杯子底部為帶有微孔的通透性的聚碳酸酯膜。transwell培養小室為上室，培養板為下室，上室內加上層培養液，下室內加下層培養液，上下層培養液以膜相隔。當把細胞接種于上室后，由于transwell小室底部的膜具有通透性，下室培養液中成分可影響上室細胞的運動。通過此方法，可比較不同細胞的遷移能力。transwell鋪上基質膠可以用來進行細胞趨化和腫瘤細胞侵襲等多方面的研究。然而，該方法在靶向敲除人TMEM121基因的sgRNA，構建TMEM121基因缺失細胞株研究上適應性較差。

發明內容