[發明專利]一種高酶活胃蛋白酶的人工改造酶及其分子改造方法和表達應用

有效

• 申請號: 202211425013.4
• 申請日: 2022-11-15
• 公開（公告）號: CN115806960B
• 公開（公告）日: 2023-10-20
• 發明（設計）人: 繆廷煒;馮英慧;榮明利;張魯嘉;吳迎紅;沈濤;杜新園
• 申請（專利權）人: 華東師范大學;寧夏夏盛實業集團有限公司;滄州夏盛酶生物技術有限公司
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64;C12N15/57;C12N15/70;C12N15/81;C12N1/21;C12N1/19;C12N15/31;C12R1/19;C12R1/84
• 代理公司: 上海灣谷知識產權代理事務所(普通合伙) 31289
• 代理人: 倪繼祖

本申請公開了一種高酶活胃蛋白酶的人工改造酶及其分子改造方法和表達應用，以催化活性位點處水的O原子與肽鍵的酰胺C原子間距離為基礎進行理性設計提高胃蛋白酶活性，對胃蛋白酶進行人工分子改造，篩選得到酶活顯著提高的突變體。本發明通過對胃蛋白酶的序列、結構和功能進行深入研究，從穩定催化結構和促進催化反應兩方面對胃蛋白酶進行突變，獲取在工業生產中更具備應用價值的高活力酶。

技術領域

本申請涉及生物工程技術領域，具體而言，涉及一種高酶活胃蛋白酶的人工改造酶及其分子改造方法和表達應用。

背景技術

能夠切割蛋白質中肽鍵的酶被稱為蛋白酶，它們在自然界中廣泛存在。胃蛋白酶是一種十分重要的蛋白酶，它是研究天冬氨酸蛋白酶最經典常用的模型蛋白，而且在飼料添加劑、奶制品凝乳、果汁澄清、釀酒原料加工、皮革處理等工業生產中有廣泛應用。目前，胃蛋白酶在畢赤酵母體系中已經成功實現了異源表達。畢赤酵母是一種甲醇營養型的酵母，已成為實驗室和工業生產重組蛋白的重要工具，具備翻譯后可修飾、易操作等優勢。Yoshimasu等人利用AOX啟動子驅動的pHIL-S1和PHO1信號肽在畢赤酵母中實現了豬胃蛋白酶的分泌表達，從1L發酵液中獲得了～30.0mg的重組胃蛋白酶(Yoshimasu M A,Ahn J-K,Tanaka T,et al.Soluble expression and purification of porcine pepsinogen fromPichia pastoris[J].Protein Expression Purif,2002,25(2):229-236.)。安立國等人構建了胃蛋白酶原畢赤酵母pPIC3.5K-P.pastoris GS115的胞內可溶表達系統，通過纖維蛋白消化和干酪素平板篩選出高表達菌株，并優化了發酵條件，最終獲得了～56.0mg/L的表達量(劉西梅,安立國,喬憲鳳,et al.豬胃蛋白酶原a在畢赤酵母中的表達[J].江漢大學學報(自然科學版),2008,(03):59-63.)。

酶的活力是評價酶的生產應用價值的重要依據之一，它是指酶催化某一化學反應的能力，可以通過一定條件下單位時間內單位體積的底物減少量或產物生成量來表示。在工業應用中，高活力的酶具有更短的反應時間，更少的酶用量，更高的底物轉化率和更低的生產成本。因此，工業生產中對高催化活性酶的需求迫切。在試管中模擬自然選擇的定向進化策略是提高酶活性的常用方法，主要可分為兩個關鍵步驟：第一步是在目標基因中引入突變，創建豐富多樣的突變基因；第二步是對基因多樣性文庫的翻譯產物——蛋白質文庫進行篩選，識別具有活性改進的蛋白質。構建突變基因文庫的技術主要有易錯PCR、隨機引物體外重組、過度模板隨機嵌合生長、DNA改組等(陳虹.L-天冬氨酸-α-脫羧酶的蛋白質工程改造及其在β-丙氨酸生產中的應用[D]；浙江工業大學,2019.)；常用的篩選方法有微孔板篩選、細胞篩選、液滴篩選等多種高通量篩選法。盡管定向進化策略大幅推動了蛋白質工程的發展，但是實驗過程中需要構建龐大的突變文庫，工作量大且效率較低。

酶是專一性、高效性的天然生物催化劑，在食品、醫藥、廢物處理等行業廣泛使用，推動了高效、經濟、環保的工業發展。然而，科學技術的發展推動了工業生產的變革更新，大部分天然蛋白質的功能特性已經不能滿足工業加工的特定需求，需要研究者對酶進行優化改造，從而獲得適用于工業條件的酶制劑。胃蛋白酶是研究天冬氨酸蛋白酶最經典常用的模型蛋白，且在飼料添加劑、奶制品凝乳、果汁澄清、釀酒原料加工、皮革處理等工業生產中有廣泛應用。然而胃蛋白酶的活性距離理論極限仍然有很大的距離，其活性有很大的提升空間。關于胃蛋白酶、甚至天冬氨酸蛋白酶活性設計的研究很少，無法滿足工業發展的需求。

因此，如何通過構建小而精的突變文庫即可實現高酶活胃蛋白酶的有效篩選一直是本領域技術人員致力于研發的方向之一。

發明內容

本申請的主要目的在于提供一種高酶活胃蛋白酶的人工改造酶及其分子改造方法和表達應用，選擇關鍵殘基進行飽和或半飽和突變，構建小而精的突變文庫實現有效篩選，以解決目前的問題。

為了實現上述目的，本申請提供了如下技術：