[發(fā)明專利]一種高酶活胃蛋白酶的人工改造酶及其分子改造方法和表達(dá)應(yīng)用有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 202211425013.4 | 申請日： | 2022-11-15 |
| 公開（公告）號： | CN115806960B | 公開（公告）日： | 2023-10-20 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 繆廷煒;馮英慧;榮明利;張魯嘉;吳迎紅;沈濤;杜新園 | 申請（專利權(quán)）人： | 華東師范大學(xué);寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司;滄州夏盛酶生物技術(shù)有限公司 |
| 主分類號： | C12N9/64 | 分類號： | C12N9/64;C12N15/57;C12N15/70;C12N15/81;C12N1/21;C12N1/19;C12N15/31;C12R1/19;C12R1/84 |
| 代理公司： | 上海灣谷知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31289 | 代理人： | 倪繼祖 |
| 地址： | 200062 上*** | 國省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 高酶活 胃蛋白酶 人工 改造 及其 分子 方法 表達(dá) 應(yīng)用 | ||
1.一種高酶活胃蛋白酶的人工改造酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示。
2.編碼權(quán)利要求1所述高酶活胃蛋白酶的人工改造酶的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6所示。
4.一種重組表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求3中所述的核苷酸序列。
5.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求4中所述的重組表達(dá)載體。
6.權(quán)利要求2所述基因在分泌表達(dá)胃蛋白酶中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6中所述的基因在分泌表達(dá)胃蛋白酶中的應(yīng)用，其特征在于：
將所述的通過半理性設(shè)計(jì)、定點(diǎn)突變得到的新的人工改造的胃蛋白酶基因在原核細(xì)胞中，與用于原核細(xì)胞進(jìn)行基因操作所用的穿梭表達(dá)質(zhì)粒連接構(gòu)成重組表達(dá)質(zhì)粒；將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入真核細(xì)胞表達(dá)蛋白并整合入真核細(xì)胞基因組中得到重組酵母；培養(yǎng)重組酵母，誘導(dǎo)胃蛋白酶的分泌表達(dá)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7中所述的應(yīng)用，原核細(xì)胞為大腸桿菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求7中所述的應(yīng)用，其特征在于：真核細(xì)胞表達(dá)蛋白是畢赤酵母Pichiapastoris GS115表達(dá)蛋白。
10.一種如權(quán)利要求1所述的高酶活胃蛋白酶的人工改造酶的分子改造方法，其特征在于，包括以下步驟：
以PDB編號4PEP為結(jié)構(gòu)模板，以催化活性位點(diǎn)處水的O原子與肽鍵的酰胺C原子間距離為基礎(chǔ)進(jìn)行理性設(shè)計(jì)提高胃蛋白酶活性，對胃蛋白酶進(jìn)行人工分子改造，篩選得到酶活顯著提高的突變體。
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