[發明專利]一種HEL-S-283基因敲除人結腸癌HCT116細胞株的構建方法

在審

• 申請號: 202211421567.7
• 申請日: 2022-11-14
• 公開（公告）號: CN116083484A
• 公開（公告）日: 2023-05-09
• 發明（設計）人: 李磊;陳慧;沈詩慧;施培林;關秋景
• 申請（專利權）人: 華東師范大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/113;C12N15/12;C12N5/10
• 代理公司: 上海麥其知識產權代理事務所(普通合伙) 31257
• 代理人: 董紅曼

本發明涉及基因工程技術領域，具體公開了一種HEL?S?283基因敲除的人結腸癌HCT116細胞株的構建方法。本發明通過構建含有特異靶向HEL?S?283基因的sgRNA序列：TCATGGTAGGATTGTGACAAAGG和AACCATGAAGTCATCTAGCAGGG的CRISPR?V2?HEL?S?283?gRNA1和CRISPR?V2?HEL?S?283?gRNA2的重組慢病毒質粒，獲得的重組慢病毒質粒能夠將HEL?S?283gRNA1和gRNA2特異性的導入宿主細胞并通過CRISPR?Cas9系統發揮功能，最后獲得敲除HEL?S?283基因的人結腸癌HCT116細胞株，敲除結果穩定，且敲除效率高。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，尤其是涉及一種敲除HEL-S-283基因的人結腸癌HCT116細胞株的構建方法。

背景技術

結腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤。據統計，2020年結腸癌的全球發病率高達10.0％，僅次于肺癌和乳腺癌，且其在癌癥中的致死率位居所有惡性腫瘤第二位(9.4％)，僅次于肺癌。隨著社會老齡化的進展、人們飲食結構與生活方式的改變,結腸癌的發病率不斷增高。約60％患者在初診時已處于病程的中晚期,失去了根治性手術治療的機會。而早期患者根治術后一旦發生復發轉移,也將會嚴重威脅患者的生存。深入探索結腸癌的發生轉移機制，探索新型復發轉移相關標志物已成為近年來的研究熱點，對其深入探索將有助于優化結腸癌患者個體化精準治療。因此，尋找特異性高、靈敏度好、穩定性強的腸癌早期診斷標志物，明確其在腫瘤發生、轉移過程中的重要作用，有利于指導臨床-患者的治療方式，提高惡性腫瘤患者術后生存率及改善患者生活質量。

HEL-S-283也被稱為REGγ、PA28γ或11Sγ，是11S蛋白酶體激活因子家族的一員。HEL-S-283可通過激活20S蛋白酶體以非泛素和非ATP依賴的方式降解多個靶蛋白，發揮調節細胞周期、轉錄、信號傳導、死亡和免疫反應的能力。有研究者利用免疫組化法檢測了包含肺癌、甲狀腺癌、結腸癌和肝癌及相應癌旁組織的組織芯片中HEL-S-283的表達水平，發現HEL-S-283在這幾種腫瘤組織中明顯的高表達(病例數超過了50％)，進一步分析發現，HEL-S-283作用于各個信號通路參與多種腫瘤的發生發展。因此，HEL-S-283已成為腫瘤基礎研究領域的熱點之一。

CRISPR-Cas9系統是從細菌和古生菌對抗外來病毒或質粒的適應性免疫系統發展而來，包括三種不同的類型，其中TypeⅡ型的CRISPR/Cas系統的DNA內切酶Cas9只有一個亞基，結構最為簡單，所以應用也最廣泛。除了Cas9蛋白外，該系統還包括兩條短的CRISPRRNAs(crRNAs)和trans-activating?crRNAs(tracrRNA)。由于CRISPR-Cas9系統具有操作簡單，切割效率高等特點，被認為有更好的應用前景。

發明內容

本發明的目的在于克服上述現有技術存在的缺點與不足，提供一種HEL-S-283基因敲除人結腸癌HCT116細胞株及其構建方法。本發明所述HEL-S-283基因敲除人結腸癌HCT116細胞株為臨床上結腸癌的防治，發病機制的研究和抗結腸癌藥物的篩選提供了重要意義。

本發明提供了一種HEL-S-283基因敲除人結腸癌HCT116細胞株的構建方法，包括以下步驟：

(1)針對人結腸癌HCT116細胞HEL-S-283基因的編碼序列，設計得到sgRNAs序列，所述sgRNAs包含sgRNA1和sgRNA2；

(2)將步驟(1)得到的sgRNAs克隆到CRISPR-V2載體上，獲得CRISPR-V2-HEL-S-283-gRNA1和CRISPR-V2-HEL-S-283-gRNA2質粒；

(3)使用脂質體轉染法，將所述步驟(2)得到的CRISPR-V2-HEL-S-283-gRNA1和CRISPR-V2-HEL-S-283-gRNA2質粒轉染人結腸癌HCT116細胞；

(4)將轉染后的HCT116細胞常規培養36-48小時；