[發明專利]一種HEL-S-283基因敲除人結腸癌HCT116細胞株的構建方法

在審

• 申請號: 202211421567.7
• 申請日: 2022-11-14
• 公開（公告）號: CN116083484A
• 公開（公告）日: 2023-05-09
• 發明（設計）人: 李磊;陳慧;沈詩慧;施培林;關秋景
• 申請（專利權）人: 華東師范大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/113;C12N15/12;C12N5/10
• 代理公司: 上海麥其知識產權代理事務所(普通合伙) 31257
• 代理人: 董紅曼

1.一種HEL-S-283基因敲除人結腸癌HCT116細胞株的構建備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)針對人結腸癌HCT116細胞HEL-S-283基因的編碼序列，設計得到sgRNAs序列，包含sgRNA1和sgRNA2；

(2)將步驟(1)得到的sgRNAs克隆到CRISPR-V2載體上，獲得CRISPR-V2-HEL-S-283-gRNA1和CRISPR-V2-HEL-S-283-gRNA2質粒；

(3)使用脂質體轉染法，將所述步驟(2)中的CRISPR-V2-HEL-S-283-gRNA1和CRISPR-V2-HEL-S-283-gRNA2質粒共轉入人結腸癌HCT116細胞株；

(4)將轉染后的HCT116細胞株常規培養36-48小時；

(5)第一次篩選：對步驟(4)中培養后的細胞有限稀釋法獲得單克隆細胞，培養得到單克隆細胞株；

(6)第二次篩選：對步驟(5)中獲得的單克隆細胞株有限稀釋法獲得單克隆細胞，繼續培養得到HCT116?HEL-S-283^-/-單克隆細胞株；

(7)提取HCT116?HEL-S-283^-/-單克隆細胞株基因組DNA，PCR擴增sgRNA序列，分析擴增產物；無法擴增出理論長度片段的細胞株，即為HCT116?HEL-S-283^-/-細胞株。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述sgRNAs的靶序列分別為：TCATGGTAGGATTGTGACAAAGG和AACCATGAAGTCATCTAGCAGGG。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，

步驟(3)中，所述轉染中用到的轉染試劑為Lipofectamine^TM3000；

和/或，步驟(5)和步驟(6)中所述的有限稀釋法中的鋪板細胞密度為0.3～0.5個細胞/孔；

和/或，步驟(5)中，所述的培養的時間為7～14天；

和/或，步驟(6)中，所述的培養時間為7天。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(7)中，所述PCR擴增引物序列為：

Primers?for?Region?1上游引物:GGGTATCTTGTGATGGAGATGTGG

Primers?for?Region?1下游引物:GCACTTCAGGTGGGGTACTT；

Primers?for?Region?2上游引物:TCCTCCTCTTCTCTCTCTTTCCA

Primers?for?Region?2下游引物:TGAGATGGAGTTTCGCTCTTGT；

Primers?for?Region?3上游引物:GGGTATCTTGTGATGGAGATGTGG

Primers?for?Region?3下游引物:TGAGATGGAGTTTCGCTCTTGT。

5.根據權利要求1-4之任一項所述的方法構建得到的HEL-S-283基因敲除人結腸癌HCT116細胞株。

6.sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的靶序列如下：TCATGGTAGGATTGTGACAAAGG和AACCATGAAGTCATCTAGCAGGG。

7.根據權利要求6所述的sgRNA在構建HEL-S-283基因敲除人結腸癌HCT116細胞株中的應用。