[發(fā)明專利]一種靶向干擾新冠病毒S蛋白的小核酸RNA干擾及應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202211418610.4
• 申請(qǐng)日: 2022-11-14
• 公開（公告）號(hào): CN115851727A
• 公開（公告）日: 2023-03-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張韋唯;戴方平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇中方基因生物醫(yī)學(xué)科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/65;C12N15/85;A61K31/7105;A61P31/14
• 代理公司: 上海鍛創(chuàng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31448
• 代理人: 范文琦

本發(fā)明提供了一種靶向干擾新冠病毒S蛋白的小核酸RNA干擾及應(yīng)用，本發(fā)明從SARS?CoV?2 Delta中提取了S蛋白基因的813nt片段作為shRNA靶點(diǎn)；813nt含有S蛋白基因RBD的大部分和的RBD之后部分下游區(qū)，基于這個(gè)813nt片段序列，設(shè)計(jì)、制備了shRNA688并進(jìn)行了RNAi實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明提供的shRNA其序列中有義序列為GGTGT TCTTA CTGAG TCTAA C，如SEQ ID NO.10所示，本發(fā)明的shRNA顯著降低了S蛋白mRNA Est813轉(zhuǎn)錄物的濃度。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種RNAi療法，具體涉及一種靶向干擾新冠病毒S蛋白的小核酸RNA干擾及應(yīng)用。

背景技術(shù)

全球新冠病毒-19大流行是由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)引起的。疫苗能顯著減緩陽(yáng)性病例和死亡人數(shù)的增加，然而，疫苗接種可能無(wú)法完全覆蓋全球人口。此外，SARS-CoV-2變異株對(duì)先前的感染或疫苗接種而逃避免疫，這種變異株不斷出現(xiàn)。Omicron變異體的出現(xiàn)表明SARS-CoV-2進(jìn)化的速度有多快，其對(duì)當(dāng)前主要針對(duì)高度突變的棘突(S)蛋白的，基于蛋白質(zhì)干預(yù)(即疫苗、抗體或恢復(fù)期血漿)的潛在影響不容忽視?？剐鹿诓《舅幬镏委熤械囊粋€(gè)新興概念涉及基于核酸的療法的開發(fā)，該療法可以降解病毒基因組，并可以根據(jù)病毒突變而快速調(diào)整。基于核酸的療法包括小干擾RNA(siRNAs)。這些約19～21個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)的非編碼RNA雙鏈，能夠通過介導(dǎo)靶向mRNA降解，以序列特異的方式擊倒靶基因的表達(dá)。經(jīng)細(xì)胞攝取后，siRNA雙鏈被加載到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)中。雙鏈被加工成單鏈，與細(xì)胞質(zhì)中存在的互補(bǔ)RNA具有高度特異性結(jié)合，導(dǎo)致其分離。正在進(jìn)行的疫情大流行促使多個(gè)研究小組評(píng)估基于siRNA的新冠病毒治療。雖然迄今為止發(fā)表的大多數(shù)研究都回顧了RNA干擾治療新冠病毒的潛力，通過計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)研究進(jìn)行了描述，也提供了初步的概念推理認(rèn)證，即SARS-CoV-2可以被siRNA抑制。針對(duì)SARS-CoV-2RNA基因組的Orf1a/b區(qū)域設(shè)計(jì)的siRNA，編碼非結(jié)構(gòu)蛋白(nsp)，進(jìn)行了測(cè)試。發(fā)現(xiàn)了一種高效抑制SARS-CoV-2復(fù)制的siRNA。對(duì)共同表達(dá)針對(duì)SARS-CoV-2RdRp和N基因的短發(fā)夾RNA(shRNAs)混合物的腺相關(guān)病毒載體進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，RNAi具有治療干預(yù)的潛力和前景。深入了解有效抑制病毒復(fù)制是制定有效抗病毒策略的必要條件。

SARS-CoV-2是一種有外殼的單鏈大RNA病毒，具有5'端非翻譯區(qū)(UTR)，ORF1a/bRNA編碼非結(jié)構(gòu)病毒蛋白，3'端段編碼結(jié)構(gòu)蛋白，例如與人宿主細(xì)胞上的人類血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(hACE2)受體結(jié)合的S蛋白，以及參與病毒粒子組裝的核衣殼N蛋白，和3'UTR。作為對(duì)新冠病毒大流行的全球應(yīng)對(duì)措施，公共數(shù)據(jù)庫(kù)中提供了大量SARS-CoV-2變體的基因組，包括SARS-CoV-2變體S蛋白基因和蛋白質(zhì)序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/？Term＝SARS-CoV-2％2C+S+protein).S蛋白的動(dòng)態(tài)特性，尤其是更易傳播的Delta和Omicron變體已經(jīng)發(fā)布了。Omicron S蛋白，包括RBD中積累了更多的突變。S蛋白受體結(jié)合域(RBD)的突變影響其與ACE2的親和力。SARS-CoV-2具有較大的RNA基因組，但在人肺上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制時(shí)，沒有整合到人類基因組中。病毒的復(fù)制是一個(gè)連續(xù)的過程，而亞基因組mRNA的轉(zhuǎn)錄是一個(gè)不連續(xù)的過程。研究了腺苷類似物(SARS-CoV-2RNA依賴RNA聚合酶抑制的主要重組藥物)的抗病毒效果。使用核酸反義寡核苷酸被描述為一種潛在的針對(duì)SARS-CoV-2RNA的新型治療策略。與SARS-CoV-2的5′先導(dǎo)序列結(jié)合的反義寡核苷酸破壞了高度保守的干環(huán)結(jié)構(gòu)，具有納米級(jí)效力，可防止病毒在人類細(xì)胞中復(fù)制。

對(duì)于阻止SARS-CoV-2大流行新疫苗和藥物的發(fā)明迫在眉睫。雖然目前已經(jīng)研發(fā)制備了一些具有預(yù)防效果的疫苗和治療性的中和抗體來針對(duì)已發(fā)現(xiàn)的SARS-CoV-2。但是，由于病毒正在不斷變異，之前的成果已經(jīng)不能滿足對(duì)付病毒新的突變株。許多國(guó)家的科學(xué)家也都在爭(zhēng)分奪秒地研制抗病毒的治療藥物。