[發明專利]一種測定α-淀粉酶活力的方法

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• 申請號: 202211417997.1
• 申請日: 2022-11-14
• 公開（公告）號: CN115901649A
• 公開（公告）日: 2023-04-04
• 發明（設計）人: 張永勤;呂興霜;陳相玉;鄔雅喃;鄭繼鵬;沈悅聰;邢明霞;許文廷;劉銀春;董靜文;劉建瑞;劉芳;劉展祥
• 申請（專利權）人: 青島科技大學
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N1/38;G01N1/44
• 代理公司: 青島中天匯智知識產權代理有限公司 37241
• 代理人: 郝團代

本發明屬于酶活力測定技術領域，針對現有的淀粉酶活力測定技術存在的靈敏度低、不符合化學計量性、底物溶解性差、標準曲線截距偏離原點的問題，本發明提供一種α?淀粉酶活力的測定方法，以淀粉或羥丙基淀粉為底物配制底物溶液，取用底物溶液為溶劑配制的不同濃度的葡萄糖標準溶液，在堿性條件下加入新鮮配制的MBTH試劑，加入硫酸鐵銨試劑，進行顯色反應，測定吸光度值，根據每組葡萄糖濃度與測得的吸光度值之間的關系繪制標準對應關系曲線；取用底物溶液，加入淀粉酶，進行酶解反應，并測定吸光度值；計算淀粉酶活力。與現有技術的MBTH法相比該方法更靈敏、更準確，顯色產物更加穩定。

技術領域

本發明屬于酶活力測定技術領域，具體涉及的是一種測定α-淀粉酶活力的方法。

背景技術

淀粉酶是一種能降解淀粉等含有α-1,4-葡萄糖苷鍵的多糖水解酶。淀粉酶廣泛用于醫藥、醫療診斷、食品、飼料、生物能源等，酶活力是其關鍵參數，一般采用測定酶促反應初速度的方法來測定酶活力。根據《WS/T349-2011α-淀粉酶催化活性濃度測定參考方法》，淀粉酶的活力單位可被定義為在37℃，最適pH的條件下每毫升反應液，每分鐘產生1μmol相當于葡萄糖的還原端基的量為一個酶活力單位，所測的酶活力包括內切、外切淀粉的糖苷鍵總酶活力。

目前淀粉酶活力測定方法還存在下列問題：

底物問題。目前市售的淀粉有玉米淀粉、土豆淀粉、可溶性淀粉等，玉米淀粉、土豆淀粉的溶解性較差，需加熱才能溶解，然而溶解過程中伴隨著其粘度的大幅度增大，高粘度致使酶與底物之間的傳質速率極低，酶解反應歷程為非零級反應，很難保證淀粉酶的酶活力測定方法的準確性；市售可溶性淀粉也需要加熱才能將其溶解，雖然其粘度已大幅度降低，但是，冷卻后又會有沉淀析出，為此，在《WS/T349-2011α-淀粉酶催化活性濃度測定參考方法》中，使用人工合成底物4,6-亞乙基(G1)-4-硝基苯(G7)-α-(1-4)-D-麥芽七糖(EPS)測定酶活力，但該底物價格極其昂貴，且非天然底物，其表觀酶活力相對較低，因此，無法作為淀粉酶生產和應用企業的常規測試方法。

目前常用DNS法測定淀粉酶活力(GB/T?36861-2018)，該方法的靈敏度相對較低。低靈敏度的測定方法對酶活力測定有兩方面影響。一方面，需較大的底物酶解率才可以測得酶解產物的還原端基的濃度，無法測得酶解初速度；另一方面，需較高的酶濃度，而酶溶液中的雜質濃度也相應較高，它們對淀粉酶的激活或抑制作用會更明顯。此外，DNS法的葡萄糖濃度標準曲線的截距較大，不過坐標軸原點，淀粉酶的不同稀釋倍數會直接影響到淀粉酶活力測定的準確性，有關DNS法不符合化學計量學的問題已早有報導(Mccleary?B?V,Mcgeough?P.A?Comparison?of?Polysaccharide?Substrates?and?Reducing?SugarMethods?for?the?Measurement?of?endo-1,4-β-Xylanase[J].Applied?BiochemistryBiotechnology,2015,177(5)：1152–1163)。

申請號為202010619456.1的中國專利文獻公開了一種母乳α-淀粉酶活性檢測方法，將新鮮母乳樣本與飽和硫酸銨溶液混合，充分震蕩搖勻后，離心取清液，然后運用碘-淀粉比色法實現母乳α-淀粉酶活性測定，該方法的缺點是淀粉溶液不穩定、易出現凝沉，對結果干擾較大，且低效耗時。

MBTH法(張永勤,王哲平,徐杰,薛長湖,詹志春.MBTH法測木糖含量的研究[J].食品科技,2010,35(04):247-250.DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2010.04.027.)可以用于測定木聚糖酶、溶菌酶及種β-葡聚糖酶的活力，發明人在使用MBTH法測定α-淀粉酶活力時，發現顯色產物不夠穩定，導致葡萄糖標準曲線的斜率隨時間發生明顯變化。此外，在現有技術中，酶活力的計算基于葡萄糖濃度標準曲線，而酶解液中的底物也有還原端基，二者共同參與MBTH反應，因此，在優化葡萄糖濃度測定方法時，必須考慮底物對葡萄糖測定的影響。上述這些問題將直接影響到α-淀粉酶活力測定的準確性、重復性和穩定性。。

發明內容