[發明專利]一種測定α-淀粉酶活力的方法

在審

• 申請號: 202211417997.1
• 申請日: 2022-11-14
• 公開（公告）號: CN115901649A
• 公開（公告）日: 2023-04-04
• 發明（設計）人: 張永勤;呂興霜;陳相玉;鄔雅喃;鄭繼鵬;沈悅聰;邢明霞;許文廷;劉銀春;董靜文;劉建瑞;劉芳;劉展祥
• 申請（專利權）人: 青島科技大學
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N1/38;G01N1/44
• 代理公司: 青島中天匯智知識產權代理有限公司 37241
• 代理人: 郝團代

1.一種測定淀粉酶活力的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)配制底物溶液和淀粉酶溶液：將淀粉或羥丙基淀粉分散到強堿溶液中，充分混勻直至底物溶解，并調整pH至待測pH，再用待測pH的緩沖溶液定容；或者將淀粉或羥丙基淀粉分散到待測緩沖液中，在70-100℃條件下加熱至底物溶解；所述的待測pH為測定淀粉酶活力的pH值；所述的羥丙基淀粉的摩爾取代度為0.05-0.5；

用同一所述緩沖溶液配制淀粉酶溶液；

(2)繪制葡萄糖吸光度值與葡萄糖濃度的標準對應關系曲線：

a.用步驟(1)配制的底物溶液，配制一系列濃度梯度的葡萄糖標準溶液，所述一系列葡萄糖標準溶液中的底物的濃度相同，并且葡萄糖濃度范圍在0-0.3mmol/L；

b.向所述一系列濃度梯度的葡萄糖標準溶液中加入堿性試劑得到堿性葡萄糖標準溶液，所述堿性葡萄糖標準溶液中的堿性試劑的濃度相同，然后加入新鮮配制的MBTH試劑，體系中OH^-濃度為0.01-0.2mol/L，MBTH的濃度范圍為0.3-4.5mmol/L，DTT的濃度范圍為0-1.6mmol/L，在50-90℃條件下反應5-180min，再加入酸性鐵試劑，體系中H⁺濃度為0.02-0.3mol/L，Fe³⁺的初始濃度范圍為1-6mmol/L，反生顯色反應，顯色穩定后在580-680nm波長下測定吸光度值，根據每組葡萄糖濃度與測得的吸光度值之間的關系繪制標準對應關系曲線；

所述的MBTH試劑是由MBTH和DTT配制而成的水溶液，或者只由MBTH配制而成的水溶液；所述酸性鐵試劑是由可溶性Fe³⁺鹽和強酸配制而成的水溶液；

(3)淀粉酶的酶解反應：向淀粉酶溶液中加入步驟(1)配制的底物溶液，保證所得溶液中底物的濃度與步驟(2)葡萄糖標準溶液中底物的濃度相同，然后進行酶解反應，再加入堿性試劑，終止酶解反應，得到堿性酶解液，所述堿性酶解液中堿性試劑的濃度與步驟(2)堿性葡萄糖標準溶液中堿性試劑的濃度相同；

(4)制備堿性酶解空白溶液；

(5)測定堿性酶解液和堿性酶解空白溶液：根據步驟(2)的方法進行MBTH反應，測定堿性酶解液和堿性酶解空白溶液，從而獲得酶解產生的還原端基的濃度，進而得到淀粉酶活力。

2.根據權利要求1所述的淀粉酶活力的測定方法，其特征是，所述的步驟(1)淀粉為馬鈴薯淀粉、玉米淀粉或者可溶性淀粉。

3.根據權利要求1所述的淀粉酶活力的測定方法，其特征是，所述的強堿為NaOH或KOH。

4.根據權利要求1所述的淀粉酶活力的測定方法，其特征在于：步驟(2)中，所述酸性鐵試劑的組成中，可溶性Fe³⁺鹽為硝酸鐵、氯化鐵、硫酸鐵銨中的至少一種，強酸為氨基磺酸、鹽酸或硫酸中的至少一種。

5.根據權利要求1所述的淀粉酶活力的測定方法，其特征在于：所述步驟(2)，向堿性葡萄糖標準溶液中加入MBTH后，體系中OH^-濃度范圍為0.1-0.2mol/L，MBTH的濃度范圍為0.95-3.6mmol/L，DTT的濃度為0mmol/L；

加入酸性鐵試劑后，體系中H⁺濃度范圍為0.06-0.1mol/L，Fe³⁺的初始濃度范圍為3-5mmol/L。

6.根據權利要求1所述的淀粉酶活力的測定方法，其特征在于：所述步驟(2)葡萄糖標準溶液與MBTH試劑的反應溫度為75-85℃，反應時間為9-17min。

7.根據權利要求1所述的淀粉酶活力的測定方法，其特征在于：所述步驟(2)加入酸性鐵試劑后，體系自然冷卻至室溫，顯色穩定后測定吸光度值。

8.根據權利要求1所述的淀粉酶活力的測定方法，其特征在于：所述步驟(2)吸光度值的測定波長為590-680m。

9.根據權利要求1所述的淀粉酶活力的測定方法，其特征在于：所述步驟(2)加入酸性鐵試劑后的顯色時間為50-180min，在該顯色時間內測定吸光度值，吸光度值的測定波長為590-610nm。