[發明專利]一種高靈敏熒光PCR檢測引物和探針改進結構及其應用

在審

• 申請號: 202211410397.2
• 申請日: 2022-11-11
• 公開（公告）號: CN116121453A
• 公開（公告）日: 2023-05-16
• 發明（設計）人: 李紅玉;顏蓉;韓勛領
• 申請（專利權）人: 重慶浦濟生命科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6886;C12Q1/6806;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 重慶坤源衡泰律師事務所 50255
• 代理人: 桑洋洋

本發明提供了一種高靈敏熒光PCR檢測引物和探針改進結構及其應用，屬于基因檢測技術領域。本發明的改進引物結構從5’到3’端包括四個部分：第一部分與第三部分序列反向互補配對；第二部分和第四部分序列與目的基因序列互補配對。本發明的改進探針結構從5’到3’端包括五個部分：第一部分和第三部分序列與目的基因待測序列互補配對；第二部分和第四部分序列反向互補配對，第五部分與第三部分序列相同。上述引物和探針改進結構用于人SDC2基因甲基化、新型冠狀病毒ORF1ab基因和N基因的PCR檢測具備靈敏度高、特異性好的優點，可作為高靈敏檢測體系在腫瘤液體活檢的痕量突變、超低含量病原微生物以及干擾DNA存在過多等方面進行精準檢測。

技術領域

本發明屬于基因檢測技術領域，具體涉及一種高靈敏熒光PCR檢測的引物和探針改進結構及其檢測體系與應用，主要用于非診斷性的腫瘤液體活檢的痕量突變、超低含量病原微生物以及干擾DNA存在過多方面的熒光PCR檢測。

背景技術

PCR技術是一種核酸體外擴增技術，其基本原理是體外模擬DNA的天然復制過程，因具有靈敏度高、特異性強、操作簡便等特點被廣泛應用。但該法只能對產物進行定性分析或半定量分析，不能準確定量，且在產物鑒定分析比較復雜時，容易出現污染和假陽性等問題。

實時熒光定量PCR技術作為第二代PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，通過不同的熒光檢測方法來定量核酸的技術。該技術實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且不容易出現污染，具有比第一代PCR更高的靈敏性、特異性和精確性、定量準確、可實時監測等優點。但該方法是通過與參照物比較后計算出定量結果，依賴于Ct值、標準曲線和參照樣本，仍然屬于相對定量的范疇，在極微量核酸樣本檢測、干擾物存在下的特異性檢測、稀有突變檢測、表達量微小差異鑒定方面，存在靈敏度不夠高和假陰性的缺陷。

國內外科研工作者對實時熒光定量PCR檢測的特異性引物和探針進行了大量研究，開發出了一系列用于檢測各類核酸的引物和探針。與該技術應用之初相比，隨著研究的不斷深入，PCR檢測的引物和探針結構得到了不斷改進，用于PCR檢測的特異性和靈敏度也得到不斷提高。但在腫瘤液體活檢的痕量突變、超低含量病原微生物以及干擾DNA存在過多等方面，仍然存在靈敏度較低的問題。

結直腸癌是三大最常見的惡性腫瘤之一，具有發病率高、病死率高等特點，嚴重威脅患者的生命健康，加強結直腸癌篩查及發現合適有效的篩查方法，對提高早期腫瘤的檢出率和降低病死率具有重要意義。結腸鏡雖然是篩查結直腸癌的金標準，但需要煩瑣而耗時的腸道準備，且作為侵入性檢查手段有出血和穿孔的風險，被篩查人群的參與率低。

大量研究^[1]表明，DNA甲基化能引起染色質結構、DNA構象、DNA穩定性及DNA與蛋白質相互作用方式的改變，從而控制基因表達；并廣泛存在于多種腫瘤。另有研究^[2]表明，糞便DNA甲基化水平改變與結直腸癌發生發展關系密切，且異常甲基化常發生在結直腸腫瘤早期，對近遠端結直腸癌(CRC)及大腺瘤(直徑≥1cm)檢測具有較高準確率。因此，以結直腸癌高危人群的糞便樣品中人類SDC2基因為目標基因，檢測其甲基化水平，可做為腫瘤標志物用于結直腸癌的早期篩查。

廣大學者對檢測人類糞便中SDC2基因甲基化的引物和探針進行了大量研究，取得了一系列重要成果，雖然使得對基因甲基化的檢測靈敏度得到有效提升，但在面臨甲基化突變比例較低以及DNA樣本含量較少時，其檢測靈敏度仍然無法達到高要求。

專利文獻CN?109943638?A^[3]公開了一種檢測SDC2基因甲基化的引物探針組合，其對結直腸癌的檢測具有較好的特異性，然而該引物探針組合對于提取的DNA樣本僅可完成200ng～2μg的檢測，對于更低量的DNA樣本，其檢測靈敏度有待進一步提升。