[發明專利]一種高靈敏熒光PCR檢測引物和探針改進結構及其應用

在審

• 申請號: 202211410397.2
• 申請日: 2022-11-11
• 公開（公告）號: CN116121453A
• 公開（公告）日: 2023-05-16
• 發明（設計）人: 李紅玉;顏蓉;韓勛領
• 申請（專利權）人: 重慶浦濟生命科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6886;C12Q1/6806;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 重慶坤源衡泰律師事務所 50255
• 代理人: 桑洋洋

1.一種熒光PCR檢測改進引物結構，其特征在于，包括正向引物和反向引物，所述正向引物從5’端到3’端包括以下四個部分：

第一部分：長度為4-10個堿基，其序列與人類基因組序列同源性低；

第二部分：長度為15-20個堿基，其序列與目的基因的一條待測序列互補配對；

第三部分：其序列與第一部分反向互補配對；

第四部分：長度為3-5個堿基，其序列與目的基因的一條待測序列互補配對，且與第二部分3’相隔2-3個堿基；

所述反向引物第一部分和第三部分與正向引物相同，第二部分和第四部分的序列分別與目的基因另一條待測序列互補配對。

2.根據權利要求1所述的改進引物結構，其特征在于，所述正向引物和反向引物中第一部分序列均為TAACATA，第三部分序列均為TATGTTA。

3.根據權利要求1或2所述的改進引物結構，其特征在于，所述目的基因包括人SDC2基因甲基化序列、新型冠狀病毒ORF1ab基因或N基因。

4.一種用于高靈敏熒光PCR檢測的改進探針結構，其特征在于，所述探針從5’端到3’端包括以下五個部分：

第一部分：長度為10-15個堿基，其序列與目的基因待測序列互補配對；

第二部分：長度為4-6個堿基，其序列與人類基因組序列同源性低；

第三部分：長度為10-15個堿基，其序列與目的基因待測序列互補配對，且與第一部分3’相隔2-3個堿基；

第四部分：其序列與第二部分反向互補配對；

第五部分：其序列與第三部分序列相同。

5.根據權利要求4所述的改進探針結構，其特征在于，所述探針的第二部分序列為GGTAGA，第四部分序列為TCTACC。

6.根據權利要求4或5所述的改進探針結構，其特征在于，所述目的基因包括人SDC2基因甲基化序列、新型冠狀病毒ORF1ab基因或N基因。

7.根據權利要求4或5所述的改進探針結構，其特征在于，所述探針5’端連接有熒光基團，所述熒光基團包括FAM、VIC、HEX、CY5或ROX，探針3’端連接有淬滅基團，所述淬滅基團包括TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或Dabcy1。

8.一種高靈敏熒光PCR檢測體系，其特征在于，包括如權利要求1-3任一項所述的引物結構和權利要求4-7任一項所述的探針結構。

9.一種ARMS-PCR檢測方法，其特征在于，采用如權利要求1-3任一項所述的引物結構和權利要求4-7任一項所述的探針結構，并將突變位點設置在引物的第四部分。

10.如權利要求8所述的高靈敏熒光PCR檢測體系在用于非診斷性的腫瘤液體活檢的痕量突變、超低含量病原微生物以及干擾DNA存在過多方面的PCR檢測中的應用。