[發明專利]一種利用脂質轉運蛋白基因啟動子調控目的基因表達的方法、轉化載體及其應用

在審

• 申請號: 202211397159.2
• 申請日: 2022-11-09
• 公開（公告）號: CN115820725A
• 公開（公告）日: 2023-03-21
• 發明（設計）人: 黎凌;賀威智;王偉;劉航;唐克軒;付雪晴;孫小芬;趙靜雅
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/56;C12N15/113;A01H5/00;A01H6/00
• 代理公司: 上海旭誠知識產權代理有限公司 31220
• 代理人: 鄭立

本發明涉及一種利用脂質轉運蛋白基因啟動子調控目的基因在植物分泌型腺毛中表達的方法、在該方法中應用的載體和其在植物腺毛組織表達和生產代謝產物的基因工程育種中的應用。所述啟動子為AaLTP1基因的啟動子，能夠調控目的基因在植物分泌型腺毛中特異表達。同時本發明還涉及前述基因啟動子在利用植物腺毛組織表達和生產代謝產物的基因工程育種中的用途。由于利用植物腺毛特異表達的啟動子對植物的腺毛系統進行遺傳操作時，不會對植物的生長發育造成危害。因此，本發明對利用植物腺毛組織表達和生產代謝產物的基因工程育種具有重要意義。

技術領域

本發明涉及植物基因工程技術領域，尤其涉及一種利用脂質轉運蛋白基因啟動子調控目的基因表達的方法、轉化載體及其應用。

背景技術

青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿屬一年生草本植物，植株有濃烈的揮發性香氣，其植株中含有許多次級代謝產物：青蒿素、揮發油、α-蒎烯、樟腦、青蒿酮等，此外還含有很多黃酮類化合物。青蒿素(Artemisinin)是從其地上部分分離出的一種含有過氧橋結構的倍半萜內酯化合物，作為世界衛生組織(WHO)推薦的抗瘧疾藥物聯合治療(Artemisinin-based combination therapies，ACTs)的主要有效成分。目前青蒿素的主要來源是從青蒿的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低(0.01％-1％)，這使得這種藥物的大規模商業化生產受到了極大限制。

青蒿的葉片表面有兩種表皮毛：分泌型腺毛(glandular secretory trichomes，GSTs)和非分泌型表皮毛(T-shape trichomes，TSTs)，兩種表皮毛對于植物的生長、發育、防御、花粉傳播等都起到至關重要的作用。啟動子是位于基因5'端上游的特定核苷酸序列，就像一個“開關”，通過順式作用元件和反式作用因子的相互作用來發揮其特定的功能。啟動子一共分三種：組成型啟動子、特異型啟動子、誘導型啟動子。在目前青蒿的基因工程研究中，多采用組成型啟動子，例如花椰菜花葉病毒35S啟動子(CaMV35S)，這種啟動子能夠驅動外源基因在所有的組織和器官中表達，而不能在特異組織和器官中調控目的基因的表達，會過度消耗細胞內的物質和能量，極可能對植物造成一定的負擔和危害，影響植物的正常生長。因此急需找到在植物的組織器官中特異性表達的啟動子來代替組成型啟動子，更好地對植物基因進行調控。由于以腺毛特異表達的啟動子對于植物的腺毛系統進行遺傳操作，不會對植物的生長發育造成危害，可以克服組成型啟動子的種種弊端。植物脂質轉運蛋白基因LTPs具有多種生理功能，包括植物信號傳導，角質和蠟代謝合成，細胞壁延伸，花粉發育，體細胞胚胎發生，種子發芽、生物脅迫和非生物脅迫。因此，克隆到植物腺毛組織特異表達的AaLTP1基因啟動子對于青蒿素代謝工程具有十分重要的意義。

因此，本領域的技術人員致力于開發一種不會對植物生長造成危害的的啟動子。

發明內容

為了克服現有植物基因工程技術的不足，同時為深入研究分泌型腺毛的起始和發育以及其中的次級代謝產物的代謝調控。本發明提供一種在植物分泌型腺毛中特異表達的啟動子，能引導基因在轉基因植物的分泌型腺毛中特異表達，并不會對植物的生長發育造成危害。

為實現上述目的，本發明提供了一種利用脂質轉運蛋白基因啟動子調控目的基因在植物分泌型腺毛中表達的方法，其特征在于，所述脂質轉運蛋白基因為植物腺毛組織特異表達的AaLTP1基因，所述基因的啟動子為SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

在本發明的較佳實施方式中，方法包括以下步驟：

步驟一，培養青蒿無菌苗；

步驟二，利用步驟一中培養的青蒿無菌苗通過PCR克隆獲取AaLTP1啟動子；

步驟三，分析AaLTP1啟動子上面的順式作用元件，確定AaLTP1基因啟動子類型；

步驟四，將步驟二中克隆到的啟動子連接連入pCAMBIA1391z載體，并融合報告基因，構建轉化載體；