[發明專利]一種利用脂質轉運蛋白基因啟動子調控目的基因表達的方法、轉化載體及其應用

在審

• 申請號: 202211397159.2
• 申請日: 2022-11-09
• 公開（公告）號: CN115820725A
• 公開（公告）日: 2023-03-21
• 發明（設計）人: 黎凌;賀威智;王偉;劉航;唐克軒;付雪晴;孫小芬;趙靜雅
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/56;C12N15/113;A01H5/00;A01H6/00
• 代理公司: 上海旭誠知識產權代理有限公司 31220
• 代理人: 鄭立

1.一種利用脂質轉運蛋白基因啟動子調控目的基因表達的方法，其特征在于，所述脂質轉運蛋白基因為植物腺毛組織特異表達的AaLTP1基因，所述基因的啟動子為SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列。

2.如權利要求1所述的一種利用脂質轉運蛋白基因啟動子調控目的基因表達的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一，培養青蒿無菌苗；

步驟二，利用步驟一中培養的青蒿無菌苗通過PCR克隆獲取AaLTP1啟動子；

步驟三，分析AaLTP1啟動子上面的順式作用元件，確定AaLTP1基因啟動子類型；

步驟四，將步驟二中克隆到的啟動子連接連入pCAMBIA1391z載體，并融合報告基因，構建轉化載體；

步驟五，將步驟四中構建好的轉化載體轉化根癌農桿菌并檢測；

步驟六，將步驟五中獲得的帶有轉化載體的根癌農桿菌穩定轉化青蒿；

步驟七，PCR檢測步驟六中獲得的轉基因青蒿植株；

步驟八，啟動子所引導的GUS報告基因在植株中表達部位的確定。

3.如權利要求2所述的一種利用脂質轉運蛋白基因啟動子調控目的基因表達的方法，其特征在于，所述步驟二具體包括：

從步驟一中獲得的青蒿無菌苗葉片中提取基因組DNA，并以基因組DNA為模板，采用兩輪巢式PCR法進行擴增，其中兩輪巢式PCR中采用的引物序列包括：

PF1：ACGTTAGCTCTTTTGCTAAGGACCAT

PR1：TACTGGTTAGGTAGGTCACACACG

PF2：CTTACACGTTCTTACTTTAATTTTATA

PR2：ACCATTTCTCCACTTGCTATTACT。

4.如權利要求2所述一種利用脂質轉運蛋白基因啟動子調控目的基因表達的方法，其特征在于，所述步驟四中，所述轉化載體為pCAMBIA1391z-proLTP1載體，為構建轉化載體，向正向引物中引入BamH I酶切位點，反向引物中引入Nco I酶切位點。

5.如權利要求4所述一種利用脂質轉運蛋白基因啟動子調控目的基因表達的方法，其特征在于，所述步驟四中，引物序列如下所示：

1391z-proLTP1-F：

CAGGTCGACGGATCCCTTACACGTTCTTACTTTAATTTTATA；

1391z-proLTP1-R：

TCAGATCTACCATGGTTCTCCACTTGCTATTACTTTAATT。

6.如權利要求2所述一種利用脂質轉運蛋白基因啟動子調控目的基因表達的方法，其特征在于，所述步驟五中采用的根癌農桿菌為EHA105。

7.如權利要求2所述一種利用脂質轉運蛋白基因啟動子調控目的基因表達的方法，其特征在于，所述步驟六具體包括：使用青蒿種子進行外植體的預培養，獲得無菌苗葉片外植體，將所述葉片的外植體與帶有轉化載體的根癌農桿菌共培養，將共培養獲得的青蒿外植體轉入發芽篩選培養基上，經過2-3次繼代培養后進行篩選培養獲得篩選后的青蒿植株。

8.如權利要求2所述一種利用脂質轉運蛋白基因啟動子調控目的基因表達的方法，其特征在于，所述步驟七具體包括：

根據目的基因所在表達盒啟動子和GUS基因序列分別設計正向引物proLTP1:CTTACACGTTCTTACTTTAATTTTATA和反向引物GUSR：

ATCCAGACTGAATGCCCACA對GUS基因進行檢測。

9.一種如權利要求1-8中任一項所述的利用脂質轉運蛋白基因啟動子調控目的基因表達的方法中使用的載體，其特征在于，所述載體為pCAMBIA1391z-proLTP1載體，含有植物腺毛組織特異表達的AaLTP1基因的啟動子以及GUS報告基因。

10.如權利要求1-8任一項所述的利用脂質轉運蛋白基因啟動子調控目的基因表達的方法在植物腺毛組織表達和生產代謝產物的基因工程育種中的應用。