[發(fā)明專利]一種跨膜蛋白176B重組載體和跨膜蛋白176B的分泌表達(dá)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202211384700.6
• 申請(qǐng)日: 2022-11-07
• 公開（公告）號(hào): CN115786397A
• 公開（公告）日: 2023-03-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 余樂;盛鑫龍;劉佩佩;程昊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 優(yōu)睿賽思（武漢）生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N5/10;C12N15/66;C07K14/47
• 代理公司: 北京金智普華知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11401
• 代理人: 楊采良

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種跨膜蛋白176B重組載體和跨膜蛋白176B的分泌表達(dá)方法。跨膜蛋白176B重組載體包括表達(dá)載體和插入片段，插入片段包括按順序依次連接的編碼IgG信號(hào)肽的基因序列、編碼跨膜蛋白176B第142至第196氨基酸的基因序列和編碼mFC?6His蛋白標(biāo)簽的基因序列。本發(fā)明通過選取跨膜蛋白176B的特定片段與IgG信號(hào)肽和mFC?6His蛋白標(biāo)簽搭配，基于真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，成功實(shí)現(xiàn)了跨膜蛋白176B的分泌表達(dá)，獲取了高濃度跨膜蛋白176B重組蛋白，高濃度和高純度跨膜蛋白176B的獲取為深入研究跨膜蛋白176B的功能提供了可能，也為開發(fā)其功能性抗體提供了便利。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種跨膜蛋白176B重組載體和跨膜蛋白176B的分泌表達(dá)方法。

背景技術(shù)

跨膜蛋白(Transmembrane protein，TMEM)多與細(xì)胞間、細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳到、免疫相關(guān)疾病以及腫瘤發(fā)生、發(fā)展等相關(guān)并參與多項(xiàng)生理過程，如構(gòu)成質(zhì)膜的離子通道、活化信號(hào)轉(zhuǎn)到通路、介導(dǎo)細(xì)胞趨化、黏附、凋亡、自噬作用等。跨膜蛋白176B(TMEM176B)以前稱為TORID(耐受相關(guān)和可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄本)，最早在肺成纖維細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，屬于跨膜4A(Membrane-Spanning 4-Domains，subfamily A，MS4A)蛋白家族，定位在人第7號(hào)染色體(鼠源性定位第6號(hào)染色體)上，其在免疫細(xì)胞和某些癌癥中差異表達(dá)。有研究表明，TMEM176B對(duì)樹突細(xì)胞成熟有抑制作用，推測(cè)可能會(huì)抑制機(jī)體抗腫瘤免疫。TMEM176B在同種異體移植小鼠模型的抗原遞呈細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，但關(guān)于其在細(xì)胞內(nèi)過程中的作用仍有許多待了解。目前對(duì)跨膜蛋白家族成員尤其是TMEM176B功能報(bào)道的文獻(xiàn)甚少，表明對(duì)其研究仍處于初級(jí)階段，也為該領(lǐng)域研究提供了廣泛空間。這是因?yàn)門MEM176B定位在細(xì)胞核膜，常規(guī)方法難以分離得到純化蛋白。有研究人員通過構(gòu)建一些過表達(dá)細(xì)胞系來實(shí)現(xiàn)TMEM176B基因的持續(xù)過表達(dá)，并通過抗體進(jìn)行驗(yàn)證，以研究其性質(zhì)，但該方法只能初步判斷其功能，無法獲得高質(zhì)量的純化蛋白進(jìn)行深入研究。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種跨膜蛋白176B重組載體，并提供了基于該跨膜蛋白176B重組載體的分泌表達(dá)方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中難以獲得高質(zhì)量跨膜蛋白176B的技術(shù)問題。

本發(fā)明具體通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明的第一方面提供了一種跨膜蛋白176B重組載體，所述跨膜蛋白176B重組載體包括表達(dá)載體和插入片段，所述插入片段包括按順序依次連接的編碼IgG信號(hào)肽的基因序列、編碼跨膜蛋白176B第142至第196氨基酸的基因序列和編碼mFC-6His蛋白標(biāo)簽的基因序列；其中，所述跨膜蛋白176B第142至第196氨基酸的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

進(jìn)一步地，編碼所述跨膜蛋白176B第142至第196氨基酸的基因序列如SEQ ID NO：5所示。

進(jìn)一步地，所述IgG信號(hào)肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，編碼所述IgG信號(hào)肽的基因序列如SEQ ID NO：3所示。

進(jìn)一步地，所述mFC-6His蛋白標(biāo)簽的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，編碼所述mFC-6His蛋白標(biāo)簽的基因序列如SEQ ID NO：7所示。

進(jìn)一步地，所述表達(dá)載體包括pCDNA3.4。

本發(fā)明的第二方面提供了一種包含如上所述的跨膜蛋白176B重組載體的宿主細(xì)胞。

進(jìn)一步地，所述宿主細(xì)胞包括HEK293F細(xì)胞。

本發(fā)明的第三方面提供了一種跨膜蛋白176B的分泌表達(dá)方法，包括以下步驟：

S1、利用如上所述的跨膜蛋白176B重組載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞；