[發(fā)明專利]RNF20基因在制備無精子癥的治療藥物中的應(yīng)用及治療藥物

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202211379163.6
• 申請(qǐng)日: 2022-11-04
• 公開（公告）號(hào): CN116139297A
• 公開（公告）日: 2023-05-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李衛(wèi);王麗穎;劉超;韋華芳;孫青原
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州市婦女兒童醫(yī)療中心
• 主分類號(hào): A61K48/00
• 分類號(hào): A61K48/00;A61K31/52;A61P15/08
• 代理公司: 武漢謙源知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 42251
• 代理人: 王力

本發(fā)明涉及RNF20基因在制備因RNF20基因突變導(dǎo)致的無精子癥的治療藥物中的應(yīng)用，以及治療藥物。本發(fā)明通過將RNF20基因表達(dá)載體經(jīng)顯微注射和電轉(zhuǎn)的方式導(dǎo)入到小鼠睪丸組織中，挽救了RNF20基因缺失的幼鼠的非梗阻性無精子癥。進(jìn)一步的，通過在顯微注射物中加入自噬抑制劑，挽救了RNF20基因缺失的成年小鼠的非梗阻性無精子癥。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更特別地，涉及RNF20基因在制備無精子癥的治療藥物中的應(yīng)用及治療藥物

背景技術(shù)

男性不育疾病是困擾一些人群的世界性問題。由于醫(yī)療技術(shù)的突飛猛進(jìn)，一些男性不育疾病帶來的生育障礙可通過輔助繁殖技術(shù)(ART)來克服。但是非梗阻無精癥(non-obstruct?ive?azoospermi?a，NOA)患者由于不能產(chǎn)生有功能單倍體生殖細(xì)胞，因此，現(xiàn)有的ART無法解決NOA患者的生育問題。

一些NOA是因?yàn)榛蛲蛔冊(cè)斐傻模碚撋希蓪⒄９δ芑蜻f送到精母細(xì)胞或精細(xì)胞中，使這些細(xì)胞恢復(fù)正常功能，從而解決NOA患者的生育問題。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，一些NOA與基因Rnf20的突變有關(guān)。

在倫理上，外源DNA整合到人體生殖細(xì)胞中是不被允許的，因此，需要一種能夠使NOA患者的生殖細(xì)胞恢復(fù)功能但是又不會(huì)把外源DNA遺傳下去的方法。已經(jīng)有研究表明，使用一些表達(dá)質(zhì)粒(例如質(zhì)粒pCAG)可將目的基因?qū)氲郊?xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，但是不會(huì)使目的基因整合到染色體上。這為我們治療NOA提供了一種可行的思路。

發(fā)明內(nèi)容

為解決以上問題，本發(fā)明提供了RNF20基因在制備因RNF20基因突變導(dǎo)致的無精子癥的治療藥物中的應(yīng)用。

在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述RNF20基因編碼的氨基酸序列如SEQ?I?DNO:1所示。

在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述RNF20基因的核酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。

本發(fā)明還提供了一種用于因RNF20基因突變導(dǎo)致的無精子癥的治療藥物，包括RNF20基因表達(dá)載體。

在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述RNF20基因表達(dá)載體為不整合到染色體上的表達(dá)載體，并且所述表達(dá)載體的啟動(dòng)子為可在睪丸組織中表達(dá)的啟動(dòng)子。

在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體為以pCAG質(zhì)粒或pCS2⁺質(zhì)粒為骨架改造的重組質(zhì)粒。

在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體的濃度為7μg/μL。

在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述治療藥物還包括自噬抑制劑。

在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述自噬抑制劑為3-甲基腺嘌呤。

在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述自噬抑制劑的濃度為3mM。

附圖說明

圖1為顯微注射并電轉(zhuǎn)pCS2⁺-RNF20的小鼠的睪丸組織中的MYC-RNF20表達(dá)情況，其中A為曲細(xì)精管內(nèi)注射的小鼠和曲細(xì)精管間注射的小鼠的睪丸組織中的MYC-RNF20表達(dá)的免疫印跡照片；B為術(shù)后不同時(shí)間的睪丸組織提取物中的MYC-RNF20表達(dá)的免疫印跡照片。

圖2為用pCS2+-RNF20質(zhì)粒對(duì)4周齡Stra8-Rnf20^-/-小鼠進(jìn)行曲細(xì)精管內(nèi)顯微注射并電轉(zhuǎn)的挽救實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中，A為分組示意圖，B-G為術(shù)后各組小鼠的表型，其中B為曲細(xì)精管組織的HE染色照片，C為尾部附睪組織的HE染色照片，D為空管率統(tǒng)計(jì)圖，E為睪丸照片，F(xiàn)為精子濃度，G為精子顯微照片。