[發明專利]利用紅細胞內源性過氧化物酶定量檢測RhD抗原的方法

在審

• 申請號: 202211366284.7
• 申請日: 2022-11-03
• 公開（公告）號: CN115753652A
• 公開（公告）日: 2023-03-07
• 發明（設計）人: 高明;陳玉平;陳芳芳;徐丹;王布強;卞夢瑤;周蓉;卞國柱
• 申請（專利權）人: 江蘇力博醫藥生物技術股份有限公司
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N21/01
• 代理公司: 江陰市揚子專利代理事務所(普通合伙) 32309
• 代理人: 隋玲玲

本發明涉及一種利用紅細胞內源性過氧化物酶定量檢測RhD抗原的方法，屬于生物檢測技術領域。此方法為將待檢紅細胞添加至包被有抗D抗體的容器后離心，洗滌去除沒有吸附的紅細胞，加入過氧化物酶底物顯色，加終止液終止反應，在一定波長的濾光片下用酶標儀檢測吸光度值，根據OD值的大小判斷被檢紅細胞上是否有D抗原。此方法易于自動化操作且穩定性高；包被抗體用量少、樣本紅細胞經稀釋后也是微量，反應結果可以通過酶標儀進行定量，靈敏度高且特異性強。與以往紅細胞D抗原鑒定方法只能進行定性分析不同，本方法可以通過檢測OD值對陽性結果進行定量分析，OD值的大小間接反映被檢紅細胞上D抗原的數量多少，可以間接分析是否屬于弱D以及其合子型。

技術領域

本發明涉及一種利用紅細胞內源性過氧化物酶定量檢測RhD抗原的方法，屬于生物檢測領域。

背景技術

Rh血型系統是43個血型系統中最復雜的血型系統，是僅次于ABO血型系統的具有重要臨床意義的血型系統，Rh血型系統中又以RhD最為重要，屬于臨床輸血前檢查的必查項目。根據RhD抗原的有無，臨床將紅細胞區分為RhD陽性和RhD陰性兩大類，其中RhD陰性在漢族人中所占比例為3-5%。RhD陰性受血者輸注RhD陽性血液，會使受血者產生抗D抗體，再次輸血時會產生溶血性輸血反應；RhD陰性的母體在分娩RhD陽性胎兒時，也可能導致母體因胎兒的RhD陽性血而免疫，再次懷孕RhD陽性胎兒，就有可能產生胎兒新生兒溶血病。因此，正確判定RhD血型，具有重要的臨床意義，屬于臨床輸血前檢查的必查項目。

目前通用的RhD血型鑒定方法利用抗D抗體和紅細胞在體外發生凝集反應的原理，常用的方法有玻片法（紙片法）、試管法、微板法、微柱凝膠法等方法（玻片法、試管法、微板凝集法、微柱凝膠法均記載于《全國臨床檢驗操作規程》中）。其中利用凝集反應的原理在96孔微板上進行的血型鑒定與本方案從反應載體上講，有相似之處，但與本方案的血型鑒定原理完全不同。利用凝集反應的原理在微板上進行的RhD血型鑒定是以抗D抗體與紅細胞形成的凝集塊的大小判斷凝集強度，從而達到區分RhD陽性和RhD陰性的目的。但是，這些方法均存在缺陷，例如：

玻片法和試管法需要人工操作，費時費力，還容易產生人為誤差；

微板凝集法抗體和紅細胞的加樣量和抗體批間差異會影響結果的穩定性；

微柱凝膠法在運輸過程中試劑凝膠容易變形和產生氣泡，影響檢測結果。

CN113092793A提供了一種基于固相吸附的檢測Rh血型抗原的正定型方法，此方法為將待分型紅細胞與Rh血型抗體添加至包被有其他物種第二抗體的容器中進行離心后，觀察待分型紅細胞在包被有其他物種第二抗體的容器底部是否被吸附，若待分型紅細胞在包被有其他物種第二抗體的容器底部被吸附，則待分型紅細胞與該Rh血型抗體對應的Rh血型抗原為陽性，若待分型紅細胞在包被有其他物種第二抗體的容器底部不被吸附，則待分型紅細胞與該Rh血型抗體對應的Rh血型抗原為陰性；此方法靈敏度高，特異性強，檢測成本低，且具有易于自動化操作的優勢，能避免操作過程中的人為誤差。但該方法仍需通過肉眼或CCD來判定吸附情況，是一種定性檢測方法，不同的人對同一個結果可能產生判別差異，機器CCD判別也容易產生誤差。

發明內容

為解決上述問題，本發明提供了一種利用紅細胞內源性過氧化物酶定量檢測RhD抗原的方法，所述方法包含鑒定步驟；所述鑒定步驟為：將待檢紅細胞添加至包被有抗D抗體的容器中進行離心，離心結束后，用生理鹽水洗滌微孔板3-6次，最后一次洗滌完成后用吸水紙吸干微孔板中殘余液體，加入過氧化物酶底物，利用紅細胞內源性過氧化物酶顯色3-20分鐘，用酸性溶液終止反應2-10分鐘，置酶標儀在特定波長下測定OD值，根據OD值的大小判定被檢樣本的RhD血型；

若待檢紅細胞在包被有抗D抗體的容器檢測OD值均小于Cutoff值，則待檢紅細胞的RhD血型為陰性；

若待檢紅細胞在包被有抗D抗體的容器檢測OD值均大于Cutoff值，則待檢紅細胞的RhD血型為陽性。

進一步的，所述離心的轉速為90-360g、時間為1-30min。