[發明專利]一種促使iPSC分化為肝臟細胞的方法及培養系統

在審

• 申請號: 202211358167.6
• 申請日: 2022-11-01
• 公開（公告）號: CN115627254A
• 公開（公告）日: 2023-01-20
• 發明（設計）人: 陳金梅;陳小華
• 申請（專利權）人: 上海市第六人民醫院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/10
• 代理公司: 上海熠澗知識產權代理有限公司 31442
• 代理人: 李慧;何靜生

本發明提供了一種誘導iPSC分化為肝臟細胞的方法和培養系統，所述培養系統包括：包含Essential 6、mTeSR^TM1 PLUS、細胞因子a、抑制劑的培養基；包含RPMI?B27、mTeSR^TM1 PLUS、細胞因子b的培養基；包含William’s E?FBS培養基、mTeSR^TM1 PLUS、細胞因子c的培養基；包含William’s E?FBS和細胞因子c的培養基。本發明通過使用生長因子和小分子結合的策略減少培養基的成本，將少量的iPSC分化后獲得3?4倍的肝細胞樣細胞，并在35天的培養后，胎兒肝細胞的表型顯著減少，成人肝細胞表型強烈表達，細胞同質性高，操作可重復性高，成功率高，更適合在臨床上的應用。

技術領域

本發明屬于干細胞分化培養技術領域，具體涉及一種促使iPSC分化為肝臟細胞的方法及培養系統。

背景技術

原代人肝細胞來源有限，體外培養難以擴增和維持表型。易于獲取(例如外周血)的人誘導多能干細胞(iPSC)為生成無限數量的肝細胞樣細胞(HLC)開辟了可能的途徑。開發高效且具有成本效益的技術以產生大量和高質量的功能性人類肝細胞對于將肝細胞應用于基于細胞的治療和藥物毒性篩選至關重要。迄今為止，已經開發了從iPSC生成HLC的方案，iPSC具有和胚胎干細胞相似的增殖能力和發育全能性，且免疫原性低、倫理問題，更適合臨床。iPSC分化的肝細胞提供了可靠且近乎無限的肝細胞來源，已被證明在肝臟疾病、毒性和藥理學研究中具有相當大的潛力。

然而，現有已經開發出的多種HLC衍生方案仍有種種局限，無法獲得統一認可。包括干細胞的肝臟分化效率低下、缺乏功能成熟度、難以長期培養，以及產量低且異質性顯著，限制了肝細胞樣細胞后期臨床的應用。體內肝臟發育發生在三維(3D)環境中，但體外培養是二維(2D)，缺乏細胞間相互作用的刺激，細胞需要接受更多的同步誘導進一步增強成熟和功能。此外，雖然肝臟的大多數細胞是肝細胞，但也包含其他細胞類型，例如Kuffer細胞、內皮細胞等，這些細胞對于肝細胞的成熟和功能也有影響。因此，還需要進一步優化當前的化學分化過程，以提高HLC分化效率和純度或改善其功能，解決生產足夠數量和質量的肝細胞以滿足臨床和其他廣泛應用的需求。

發明內容

為了解決現有技術的問題，本發明提供了一種誘導iPSC分化為肝臟細胞的方法和培養系統，使用生長因子和小分子結合的策略減少培養基的成本，將少量的iPSC分化后獲得3-4倍的肝細胞樣細胞，表現成熟肝細胞的典型形態和功能特征，并且在35天的培養后，胎兒肝細胞的表型顯著減少，成人肝細胞表型強烈表達，細胞同質性高，操作可重復性高，成功率高，更適合在臨床上的應用。

為達到此發明目的，本發明采用以下技術方案：

第一方面，本發明提供了一種促使iPSC分化為肝臟細胞的培養系統，所述培養系統包括：

第一階段培養基：包含Essential 6培養基、mTeSR^TM1 PLUS培養基、細胞因子a、抑制劑；

第二階段培養基：包含RPMI-B27培養基、mTeSR^TM1 PLUS培養基、細胞因子b；

第三階段培養基：包含William’s E-FBS培養基、mTeSR^TM1 PLUS培養基、細胞因子c；

第四階段培養基：包含William’s E-FBS培養基和細胞因子c。

作為優選方案，所述第一階段培養基中，Essential 6培養基和mTeSR^TM1 PLUS培養基的體積比為3:1；所述細胞因子a包括Activin A(激活素A)、FGF2(成纖維細胞生長因子2)、BMP4(骨形態發生蛋白)；所述抑制劑包括PI3K(磷酸肌醇-3-激酶)抑制劑、GSK-3β(糖原合成酶激酶-3β)抑制劑中的至少一種。