[發明專利]一種促使iPSC分化為肝臟細胞的方法及培養系統

在審

• 申請號: 202211358167.6
• 申請日: 2022-11-01
• 公開（公告）號: CN115627254A
• 公開（公告）日: 2023-01-20
• 發明（設計）人: 陳金梅;陳小華
• 申請（專利權）人: 上海市第六人民醫院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/10
• 代理公司: 上海熠澗知識產權代理有限公司 31442
• 代理人: 李慧;何靜生

1.一種促使iPSC分化為肝臟細胞的培養系統，其特征在于，所述培養系統包括：

第一階段培養基：包含Essential 6培養基、mTeSR^TM1 PLUS培養基、細胞因子a、抑制劑；

第二階段培養基：包含RPMI-B27培養基、mTeSR^TM1 PLUS培養基、細胞因子b；

第三階段培養基：包含William’s E-FBS培養基、mTeSR^TM1 PLUS培養基、細胞因子c；

第四階段培養基：包含William’s E-FBS培養基和細胞因子c。

2.根據權利要求1所述的促使iPSC分化為肝臟細胞的培養系統，其特征在于，所述第一階段培養基中，Essential 6培養基和mTeSR^TM1 PLUS培養基的體積比為3:1；所述細胞因子a包括Activin A、FGF2、BMP4；所述抑制劑包括PI3K抑制劑、GSK-3β抑制劑中的至少一種。

3.根據權利要求2所述的促使iPSC分化為肝臟細胞的培養系統，其特征在于，所述第一階段培養基中，Activin A、FGF2、BMP4的濃度分別為100ng/ml、80ng/ml、10ng/ml，PI3K抑制劑的濃度為5-10μM、GSK-3β抑制劑的濃度為0或3μM。

4.根據權利要求1所述的促使iPSC分化為肝臟細胞的培養系統，其特征在于，所述第二階段培養基中，RPMI-B27培養基和mTeSR^TM1 PLUS培養基的體積比為3:1；所述細胞因子b包括Activin A、FGF2中的至少一種；

所述RPMI-B27培養基以500ml總體積計，包括:480ml RPMI-1640、5ml非必需氨基酸、5ml青-鏈霉素、10ml B27；所述青-鏈霉素的濃度為1％。

5.根據權利要求4所述的促使iPSC分化為肝臟細胞的培養系統，其特征在于，所述第一階段培養基中，Activin A的濃度為50ng/ml或100ng/ml，FGF2的濃度為80ng/ml。

6.根據權利要求1所述的促使iPSC分化為肝臟細胞的培養系統，其特征在于，所述第三階段培養基中，William’s E-FBS培養基和mTeSR^TM1 PLUS培養基的體積比為3:1。

7.根據權利要求1或6所述的促使iPSC分化為肝臟細胞的培養系統，其特征在于，所述第三階段培養基和第四階段培養基中，William’s E-FBS培養基以500ml總體積計，包括:436mlWilliam’s E培養基、50mlFBS、9mlDMSO、5ml青-鏈霉素；所述William’s E-FBS培養基中還包括4.8μg/ml氫化可的松21-半琥珀酸酯、1μg/ml胰島素；

所述第三階段培養基和第四階段培養基中，細胞因子c包括OSM，OSM的添加濃度為20ng/ml。

8.一種基于權利要求1-7任一項所述的培養系統促使iPSC分化為肝臟細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：

A、將收集的iPSC進行原代培養和傳代培養；

B、將iPSC進行分化培養，具體為：先采用第一階段培養基對傳代后的iPSC進行培養，使細胞分化為定型內胚層；然后采用第二階段培養基對細胞進行培養，使細胞分化為肝內胚層；再采用第三階段培養基對細胞進行培養，使細胞分化肝母細胞；最后采用第四階段培養基對細胞進行培養，收獲肝細胞。