[發明專利]一種針對BCR-ABL融合基因的高特異性探針的設計與制備方法

在審

• 申請號: 202211357799.0
• 申請日: 2022-11-01
• 公開（公告）號: CN116287232A
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發明（設計）人: 黃錚蘭;何畏;高淼
• 申請（專利權）人: 重慶醫科大學國際體外診斷研究院
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6844;C12N15/113;C12N15/11
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在本專利中我們設計并制備了一種針對BCR?ABL融合基因的高特異性探針，首次創新性的將CRISPR?Cas12a系統運用到慢性髓細胞白血病特征性融合基因的檢測中。由于BCR?ABL是一種長鏈雙鏈DNA結構，針對其這一特點我們創新性提出多位點識別這一方法。我們根據其核酸序列，尋找多處識別位點并設計多對探針在雙鏈中進行識別。CRISPR?Cas12a系統利用其獨特的“側枝效應”，可以在識別到目標序列時切割熒光報告分子釋放熒光信號，我們可以通過檢測該熒光信號完成對BCR?ABL融合基因的定量檢測，其檢測原理見附圖。根據我們的試驗其最低檢測限可以達到nM級別，基于該探針所建立的生物傳感器在慢性髓細胞白血病的早期檢測以及預后診斷中有廣闊的應用前景。

技術領域

本發明是一種針對BCR-ABL融合基因的高特異性探針的設計，特別涉及一種基于RPA技術和多位點識別的新型CRISPR-Cas12a系統的快速檢測BCR-ABL融合基因的探針制備技術。

背景技術

慢性髓細胞白血病(chronicmyelogenousleukemia,CML)是一種起源于造血干細胞的骨髓增殖性腫瘤，主要累及粒系。CML約占成人白血病的15％，其疾病的特點是在受累的細胞中，可檢測到特征性的Ph染色體及BCR-ABL融合基因。BCR-ABL融合基因陽性是臨床上診斷CML的重要依據，也是用于患者預后疾病監測的重要檢測指標。

對于BCR-ABL融合基因的檢測，目前臨床上主要運用實時熒光定量PCR、核酸分子雜交等方法。其中經典的實時熒光定量PCR技術被廣泛使用并被認定為參考方法。然而，該方法需要昂貴的擴增儀器、大量經過培訓的實驗技術人員以及繁瑣的實驗程序，正是由于實時熒光定量PCR的這些缺點，促使研究者探索針對BCR-ABL融合基因檢測的新方法研究。

CRISPR-Cas12a系統是細菌體內的一種獲得性免疫系統,主要用來對抗侵略細菌的外源DNA、質粒以及噬菌體等物質。究其本質，是一系列由RNA引導的核酸內切酶。該體系存在于約40％的細菌和90％的古細菌中，是細菌抵御外源物質入侵的重要的一種獲得性免疫系統。當模板鏈與sgRNA堿基互補配對后會激活cas12a，活化的cas12a蛋白不僅會切割目標靶DNA，還會激發一種“側枝效應”即活化的Cas12a蛋白會附帶切割體系內的其他單鏈核酸分子。基于此，這些被側枝切割的單鏈核酸分子可以被設計為信號報告分子，即在其3’端與5’端分別修飾熒光報告基團與熒光淬滅基團，當單鏈核酸分子被切割時熒光基團與淬滅基團的分離會使體系里釋放出熒光信號，通過檢測體系內釋放的熒光信號即可完成對目的模板的檢測。

目前第一種檢測系統代表是JenniferA.Doudna團隊開發的DETECTR系統，該技術是利用核酸等溫擴增技術聯合CRISPR-Cas系統來進行核酸檢測，該技術主要使用的Cas蛋白種類為Cas12a，當sgRNA識別目標靶序列時，活化的Cas12a蛋白會參與切割體系內的單鏈DNA分子，使得修飾于該單鏈DNA分子3’端與5’端的熒光基團與淬滅基團分離，進而釋放熒光信號，該熒光信號可以被酶標儀、熒光分光光度計以及實時熒光定量PCR儀收集，我們再根據體系釋放熒光信號的強度進而完成定量檢測。

第二種檢測系統代表是張峰教授團隊開發的SHERLOCK系統，該技術是一種基于核酸等溫擴增技術聯合CRISPR-Cas來進行核酸檢測，該技術結合了多種Cas蛋白，如Cas13、Cas12a和Csm6，以便同時檢測多種類型的核酸，當sgRNA識別目標RNA靶序列后，活化的Cas蛋白參與附近非靶標RNA的側鏈切割，這使得Cas酶能夠在體外通過被標記RNA的非特異性降解來檢測病毒核酸。目前，該系統可實時、快速、特異的識別和檢測并能將該方法的檢測靈敏度提高到aM級別。

盡管CRISPR-Cas系統已經有一定程度的廣泛運用，但是針對類似于BCR-ABL融合基因這一類的長鏈DNA的識別仍存在局限性，該發明旨在基于CRISPR-Cas12a系統進行核酸檢測的基礎上，通過增加識別位點、延長孵育時間、改變反應條件等方法增強該核酸檢測系統對于長鏈DNA的識別能力，進而達到檢測BCR-ABL融合基因的能力。

發明內容