[發明專利]一種針對BCR-ABL融合基因的高特異性探針的設計與制備方法

在審

• 申請號: 202211357799.0
• 申請日: 2022-11-01
• 公開（公告）號: CN116287232A
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發明（設計）人: 黃錚蘭;何畏;高淼
• 申請（專利權）人: 重慶醫科大學國際體外診斷研究院
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6844;C12N15/113;C12N15/11
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1.一種針對BCR-ABL融合基因的高特異性探針的設計與制備方法，其技術方法包括以下相關步驟：

BCR-ABL融合基因樣品的制備：人源性慢性髓細胞白血病細胞，K562細胞用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養基在37℃、含5％CO₂的飽和濕度培養箱中培養，當細胞密度長至85-90％時，吸取3ml細胞懸液于EP管中，1500rpm離心5min，棄上清，再用預冷的PBS洗滌兩次。棄去上清后，加入1mlTRIZOL，旋渦震蕩，充分裂解，隨后在冰上靜置5min，接著往EP管內加入200ul的氯仿，劇烈震蕩15s，使懸液變為粉紅色，再在冰上靜置5min后分層，之后在4℃低溫條件下13000rpm高速離心10min，之后吸取上層水相(約200-400ul)于另一EP管中，加入等量異丙醇，輕輕顛倒混勻，冰上靜置10min，然后4℃13000rpm離心10min，棄上清，加入1ml75％乙醇(現配現用，無水乙醇：DEPC＝3:1)洗滌沉淀，4℃7500rpm離心5min，棄上清，重復洗滌一遍，然后將上清吸凈，EP管倒扣在濾紙上，室溫使RNA沉淀干燥，再加入20ulDEPC水重懸沉淀，之后測定RNA濃度，再根據RNA的濃度計算加入500ngRNA量的上樣量，再加入2ul逆轉錄預混試劑，并加DEPC配置為10ul的反應體系，根據下述反應條件進行逆轉錄反應：

之后將逆轉錄后的產物存放于-20℃，即可作為BCR-ABL融合基因的檢測樣本。

2.根據權利要求1所制備的BCR-ABL融合基因，構建相應的RPA反應體系：RPA整體反應體系主要由重組酶、聚合酶以及單鏈結合蛋白三種蛋白作為反應體系，其反應過程是先由重組酶和引物形成復合物，之后該復合物在雙鏈DNA中尋找同源序列并打開DNA雙鏈模板，再由單鏈結合蛋白穩定整體結構，同時，聚合酶在雙鏈打開的位點進行擴增。整體反應體系的配置為：Primer?F:2.4ul、Primer?R:2.4ul、buffer:29.5ul、模板DEPC:13.2ul、MgoAc:2.4ul，反應體系配置好后混勻加入到配比好的三種蛋白干粉中進行混合，按照以下溫度程序進行反應：

反應后的產物經瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

3.根據權利要求2所擴增的產物，設計針對BCR-ABL融合基因的高特異性sgRNA多位點的探針。由于常規的CRISPR-Cas12a系統對于像BCR-ABL融合基因這一類的長鏈DNA的識別能力較弱，我們創新性的通過增加模板識別位點，進而提高該系統對于長鏈DNA的識別以及穩固能力，我們在BCR-ABL融合基因跨越融合位點的區段設計了三個識別位點，我們針對每個識別位點設計了相應的互補的sgRNA序列。

4.根據權利要求3所設計的sgRNA序列，合成sgRNA探針：根據BCR-ABL融合基因的特異性融合位點區段，設計三個相應的互補的sgRNA的序列，再用亞磷酰胺合成法進行sgRNA的合成，合成后的sgRNA分裝后保存與-80℃，使用前在冰上融化，并使用預冷的75％乙醇洗滌RNA沉淀后用DEPC水稀釋為我們所需要的濃度。

5.多位點識別的CRISPR-Cas12a熒光信號放大系統的建立。為了抑制由于環境內存在的RNA酶導致的sgRNA的降解，我們選擇添加適量的RNA抑制劑(RRI)。依此，我們配制多位點識別的CRISPR-Cas12a熒光檢測體系(共100ul)如下：10×NEB?buffer2.1:3ul、sgRNA1:10ul、sgRNA2:10ul、sgRNA3:10ul、cas12a:6ul、模板(RPA反應后的產物)：10ul、RRI：1ul、熒光探針：5ul、DEPC:45ul。反應體系配制完成輕輕渦旋混勻之后在37℃水浴箱中反應35min后進行在熒光分光光度計上進行熒光信號的檢測。