[發明專利]一種單細胞全長轉錄組文庫的構建方法及其應用

在審

• 申請號: 202211352114.3
• 申請日: 2022-10-31
• 公開（公告）號: CN115820802A
• 公開（公告）日: 2023-03-21
• 發明（設計）人: 鄭洪坤;劉敏;衣春霖;張坦
• 申請（專利權）人: 北京百邁客生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C40B50/06;C12Q1/6869;C12Q1/6888
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 李正

本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及一種單細胞全長轉錄組文庫的構建方法及其應用。所述構建方法包括在beads上連接barcode序列，將連接有barcode序列的beads、油相和細胞混合后包裹形成待測油包水；針對所述待測油包水提取DNA之后進行ONT檢測。本發明通過在建庫時，采用帶有barcode序列的beads給每個細胞轉錄組加上不同barcode標記，在測序后可以進行快速的數據篩選，這使得擴增后的全長基因不需打斷，可以直接進行ONT平臺測序，較大程度上提高了檢測效率和準確率。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及一種單細胞全長轉錄組文庫的構建方法及其應用。

背景技術

傳統的轉錄組測序得到的是一群細胞基因表達的的平均水平，這種方式會導致細胞間的異質性被掩蓋，難以區分不同細胞的基因組差異。而現有的單細胞轉錄組測序能夠測定一群細胞中單個細胞基因表達水平，從大量細胞中篩選出異質細胞進行研究。但是基于流式細胞儀和激光捕獲纖維切割等技術的單細胞篩選及測序技術具有成本高、通量低的缺點；而基于barcode標簽的細胞轉錄組測序技術讀長短。

發明內容

為了解決現有技術存在的問題，本發明提供一種單細胞全長轉錄組文庫的構建方法。通過給不同細胞帶上不同baorcod序列便于測序后數據篩選；擴增后的全長基因不需打斷，可直接用ONT平臺測序。

第一方面，本發明提供一種單細胞全長轉錄組文庫的構建方法，包括：

在beads上連接barcode序列，將連接有barcode序列的beads、油相和細胞混合后包裹形成待測油包水；針對所述待測油包水提取DNA之后進行ONT檢測。

進一步地，所述連接有barcode序列beads、油相和細胞的體積比為(5～10):(20～30):(40～50)。

進一步地，所述beads上還連接有反轉錄引物；所述反轉錄引物包括如下核苷酸序列：

5’-CTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’。

進一步地，所述提取DNA包括反轉錄、破油純化和PCR擴增。

進一步地，所述反轉錄中使用的RTmix包括：0.4～0.6％ BSA和0.1～0.3％Tween20。

進一步地，如上BSA和Tween20均為配置好的，質量或體積百分含量為10％的BSA和Tween20。

本發明在反轉錄過程中，在RT mix中加入BSA，其一方面可以保護逆轉錄酶，增加酶的穩定性，又能夠對細胞起到生理和機械保護的作用。在這種情況下對于細胞活性的要求降低，一般情況下，構建單細胞轉錄組文庫對細胞活性要求80％以上，而在RT mix中加入BSA，使得本發明對于對細胞活性要求在60％以上即可。

此外，本發明還在RTmix中加入Tween 20，通常情況下，Tween20通常被認為對細胞有破壞作用，但是本發明發現低濃度Tween20對細胞活性影響較小(加上本發明加入BSA之后放寬了對細胞活性的要求)，而且在加入Tween20之后增加了細胞相流動性，縮短了油包水生成時間，在相同儀器條件下，僅需10分鐘即可形成油包水(目前現有技術中采用微流控技術生成油包水通常需要約18分鐘)，極大地減少了細胞破裂及mRNA降解對實驗的負面影響

進一步地，所述反轉錄包括如下流程：48～52℃，85～95分鐘；80～90℃，5～7分鐘；4℃以下保持；

和/或，所述PCR擴增包括如下流程：

所述PCR擴增包括如下流程：