[發(fā)明專利]一種單細胞全長轉(zhuǎn)錄組文庫的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202211352114.3
• 申請日: 2022-10-31
• 公開（公告）號: CN115820802A
• 公開（公告）日: 2023-03-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄭洪坤;劉敏;衣春霖;張?zhí)?/a>
• 申請（專利權(quán)）人: 北京百邁客生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C40B50/06;C12Q1/6869;C12Q1/6888
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 李正

1.一種單細胞全長轉(zhuǎn)錄組文庫的構(gòu)建方法，其特征在于，包括：

在beads上連接barcode序列，將連接有barcode序列的beads、油相和細胞混合后包裹形成待測油包水；針對所述待測油包水提取DNA之后進行ONT檢測。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述連接有barcode序列beads、油相和細胞的體積比為(5～10):(20～30):(40～50)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述beads上還連接有反轉(zhuǎn)錄引物；所述反轉(zhuǎn)錄引物包括如下核苷酸序列：

5’-CTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNVTVNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述提取DNA包括反轉(zhuǎn)錄、破油純化和PCR擴增。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，按體積比計，所述反轉(zhuǎn)錄中使用的RTmix包括：0.4～0.6％BSA和0.1～0.3％Tween20。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，

所述反轉(zhuǎn)錄包括如下流程：48～52℃，85～95分鐘；80～90℃，5～7分鐘；4℃以下保持；

和/或，所述PCR擴增包括如下流程：

92～98℃，10～30s；92～98℃，10～30s，55～65℃，10～30s，63～72℃，1～7min進行10～18次循環(huán)；63～72℃，5～10分鐘；4℃以下保持。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述ONT檢測包括：

末端修復(fù)及純化，連接測序接頭及純化和測序。

8.權(quán)利要求1-7任一項所述的構(gòu)建方法在篩選異質(zhì)細胞中的應(yīng)用。