[發(fā)明專利]一種Fam50b蛋白多克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202211346210.7
• 申請(qǐng)日: 2022-10-31
• 公開（公告）號(hào): CN115806614A
• 公開（公告）日: 2023-03-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 邢俊俏;王衛(wèi)華;劉紅妮;謝小燕;張熙琪;胡長(zhǎng)峰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江漢大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K16/18
• 分類號(hào): C07K16/18;C07K16/06;C12N15/70;G01N33/68
• 代理公司: 武漢智嘉聯(lián)合知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 42231
• 代理人: 張杰

本發(fā)明公開了一種Fam50b蛋白多克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用，所述多克隆抗體的制備方法具體為：構(gòu)建含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的重組表達(dá)載體，將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌并誘導(dǎo)培養(yǎng)，收集Fam50b重組蛋白，再將Fam50b重組蛋白作為抗原免疫動(dòng)物，取動(dòng)物血清得到多克隆抗體。本發(fā)明制備的Fam50b蛋白多克隆抗體不僅效價(jià)高而且特異性好，能夠用于Fam50b蛋白的檢測(cè)及其蛋白功能鑒定、細(xì)胞定位等，對(duì)進(jìn)一步研究Fam50b蛋白的生化功能奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于抗體制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種Fam50b蛋白多克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

Fam50b(Family With Sequence Similarity 50Member B)是一個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因。與Fam50b相關(guān)的疾病包括各種惡性腫瘤，前列腺癌及子宮頸癌，還可以導(dǎo)致多種先天畸形，精神發(fā)育遲緩及男性不育癥。此基因包含一個(gè)無內(nèi)含子的ORF,源于遺傳缺陷。該基因與差異甲基化區(qū)(DMR)相鄰，且在睪丸生殖細(xì)胞腫瘤中表達(dá)紊亂，提示Fam50b對(duì)精液質(zhì)量及腫瘤形成過程中起到了重要作用。

研究Fam50b蛋白的生物學(xué)功能對(duì)研究相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理以及預(yù)防該疾病的發(fā)生具有重大意義。相應(yīng)的抗體是研究該蛋白功能所需要的重要材料之一，因此Fam50b蛋白抗體對(duì)于深入研究Fam50b的生化功能以及對(duì)于人類相關(guān)疾病的防控等將具有重要的意義。然而，目前市面上的Fam50b抗體產(chǎn)品極少，且普遍存在特異性不高，效價(jià)低且價(jià)格昂貴的問題。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明旨在提供一種Fam50b蛋白多克隆抗體及其制備方法，本發(fā)明通過原核表達(dá)系統(tǒng)得到Fam50b重組蛋白，將其作為抗原免疫動(dòng)物后獲得的多克隆抗體具有良好的特異性，而且還具有制備時(shí)間短、成本低、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案具體如下：

本發(fā)明提供了一種Fam50b蛋白多克隆抗體的制備方法，具體包括以下步驟：

步驟1.構(gòu)建含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的重組表達(dá)載體；

步驟2.將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌并誘導(dǎo)培養(yǎng)，再收集Fam50b重組蛋白，所述Fam50b重組蛋白含有SEQ ID NO.2所示序列；

步驟3.將Fam50b重組蛋白作為抗原免疫動(dòng)物，取動(dòng)物血清分離純化后得到多克隆抗體。

進(jìn)一步地，在上述技術(shù)方案中，步驟1具體為：以小鼠睪丸總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，再以cDNA為模板通過PCR擴(kuò)增得到含SEQ ID NO.1所示序列的目的片段，將該片段連接至原核表達(dá)載體即得。

更進(jìn)一步地，在本發(fā)明提供的一個(gè)具體實(shí)施案例中，PCR擴(kuò)增所用引物序列如SEQID NO.3～4所示，重組表達(dá)載體的基礎(chǔ)載體為pGEX-6P-1，目的片段與載體pGEX-6P-1分別通過BamHⅠ酶和EcoRⅠ酶進(jìn)行雙酶切后連接。

進(jìn)一步地，在上述技術(shù)方案中，步驟2所述大腸桿菌具體為大腸桿菌BL21(DE3)菌株。

進(jìn)一步地，在上述技術(shù)方案中，步驟2中誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為：終濃度為0.3mM IPTG，37℃培養(yǎng)3h。

進(jìn)一步地，在上述技術(shù)方案中，所述Fam50b重組蛋白的收集方法為：離心收集菌沉淀，用PBS多次離心洗滌后，依次加入蛋白酶抑制劑和溶菌酶反應(yīng)；將菌液超聲破碎，再加入終濃度為10％ Triton-X100和1mM DTT進(jìn)行孵育，離心取上清液，純化后即得重組蛋白。

進(jìn)一步地，在上述技術(shù)方案中，步驟3中的免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為兔。

進(jìn)一步地，在上述技術(shù)方案中，步驟3中的免疫方式具體為：

初次免疫，用Fam50b重組蛋白與弗氏完全佐劑乳化混合后免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；