[發明專利]一種基于ERA技術的急性肝胰腺壞死病病原的檢測方法及應用

在審

• 申請號: 202211341770.3
• 申請日: 2022-11-02
• 公開（公告）號: CN115948582A
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發明（設計）人: 王孟強;周清倩;胡景杰;包振民;王燕;劉可欣;邵爍如
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學三亞海洋研究院;中國海洋大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/63
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 王美燕

本發明提供一種基于ERA技術的急性肝胰腺壞死病病原的檢測方法及應用，包括：(1)取急性肝胰腺壞死病致病質粒中，長度1665bp的pirAB序列作為檢測靶基因，設計并篩選RT?ERA引物組和RT?ERA熒光型探針；(2)以待測樣品的基因組DNA為模板，用設計的RT?ERA引物組和探針，在33℃?42℃下恒溫RT?ERA擴增，RT?ERA擴增產物，檢測熒光信號強度，根據15min內的擴增曲線的熒光信號值，判斷擴增結果；本發明利用實時定量酶促重組擴增技術RT?ERA建立AHPND檢測體系，可在33℃?42℃下高效擴增，20min內即可得到檢測結果，具有較高的特異性且檢出限大大降低，操作更加簡便。

技術領域

本發明涉及微生物檢測技術領域，特別涉及一種基于ERA技術的急性肝胰腺壞死病病原的檢測方法及應用_。

背景技術

我國是南美白對蝦等養殖蝦的主要生產國。自2009年以來，一種稱為急性肝胰腺壞死病(AHPND)的細菌性疾病的出現導致對蝦產量下降和嚴重的經濟損失。AHPND的特點是突然大量死亡(高達100％)，通常幼苗在養殖池中放養30-35天后受到影響。引起AHPND的細菌最初寄居在受感染蝦的胃中，隨后這些細菌產生的二元毒素在一定程度上通過胃篩進入肝胰腺。受AHPND影響的蝦表現出嗜睡、厭食、生長緩慢、消化道空虛和肝胰腺蒼白至白色。2013年，AHPND的病原體被確定為副溶血性弧菌。病原體攜帶無毒pVA1質粒(69kbp)，該毒力質粒能編碼一種二元毒素，與蘇云金芽孢桿菌(Bacillus?thuringiensis,Bt)殺蟲毒素Cry蛋白相似。pirA和pirB毒素蛋白是引起AHPND的主要致病因子，除了這些毒素基因，質粒還編碼結合轉移基因和轉座子，表明質粒具有轉移至其他菌株或物種的潛力。近期研究信息表明，pVA1質粒和變體也存在于許多其他弧菌物種中，如坎貝弧菌、哈維弧菌和歐文弧菌。隨著AHPND在中國、馬來西亞、泰國、菲律賓、越南、美國等多國的對蝦生產中爆發，給對蝦養殖產業造成了嚴重的經濟損失。

傳統的AHPND診斷方法，包括組織病理學、聚合酶鏈反應(PCR)、實時定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)、單克隆抗體測定、生物傳感器和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)等。但因需要較長的反應時間、復雜的儀器和專業的操作，而均不適合對蝦場進行現場檢查。

近年來，等溫擴增技術逐漸應用于AHPND的檢測中，如環介導等溫擴增技術(LAMP)、重組酶聚合酶擴增技術(RPA)和重組酶介導鏈替換核酸擴增(RAA)等，然而LAMP靶向序列為小片段內的6個或8個區域，因此，引物設計受到許多限制，易面臨被污染的高風險可能，RPA與凝膠電泳技術相結合，增加了檢測時間且低濃度下容易出現非特異性擴增。因此，進一步開發快速、靈敏高的實時定量酶促恒溫擴增技術(RT-ERA)的AHPND檢測方法，有利于更好地實現對本病的預防和控制_。

發明內容

鑒于此，本發明提出一種基于ERA技術的急性肝胰腺壞死病病原的檢測方法及應用，是利用實時定量酶促重組擴增技術(RT-ERA)建立了AHPND檢測體系，不僅可快速實地實時檢測，且具有較高的特異性和效率。

本發明的技術方案是這樣實現的：

本發明提供一種基于ERA技術的急性肝胰腺壞死病病原的檢測方法，包括如下步驟：

步驟1：設計并篩選檢測蝦急性肝胰腺壞死病的引物組和特異性熒光探針：

選取急性肝胰腺壞死病致病質粒中，長度1665bp的pirAB序列作為檢測靶基因，設計RT-ERA引物組和RT-ERA熒光型探針；通過基礎型擴增與熒光型擴增篩選出最優引物組與探針。

步驟2：RT-ERA檢測：以待測樣品的基因組DNA為模板，采用步驟1)設計的RT-ERA引物組和探針，在33℃-42℃下進行恒溫RT-ERA擴增，得到RT-ERA擴增產物，檢測其熒光信號強度，根據15min內的擴增曲線的熒光信號值，判斷擴增結果。