[發明專利]一種基于ERA技術的急性肝胰腺壞死病病原的檢測方法及應用

在審

• 申請號: 202211341770.3
• 申請日: 2022-11-02
• 公開（公告）號: CN115948582A
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發明（設計）人: 王孟強;周清倩;胡景杰;包振民;王燕;劉可欣;邵爍如
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學三亞海洋研究院;中國海洋大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/63
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 王美燕

1.一種基于ERA技術的急性肝胰腺壞死病病原的檢測方法，其特征在：包括如下步驟：

步驟1：設計并篩選檢測蝦急性肝胰腺壞死病的引物組和特異性熒光探針：

選取急性肝胰腺壞死病致病質粒中，長度1665bp的pirAB序列作為檢測靶基因，設計RT-ERA引物組和RT-ERA熒光型探針；

步驟2：RT-ERA檢測：以待測樣品的基因組DNA為模板，采用步驟1)設計的RT-ERA引物組和探針，在33℃-42℃下進行恒溫RT-ERA擴增，得到RT-ERA擴增產物，檢測其熒光信號強度，根據15min內的擴增曲線的熒光信號值，判斷擴增結果。

2.如權利要求1所述的一種基于ERA技術的急性肝胰腺壞死病病原的檢測方法，其特征在于：所述RT-ERA引物組的上下游引物的序列長度各為28-35個核苷酸，GC含量在40％-60％之間。

3.如權利要求2所述的一種基于ERA技術的急性肝胰腺壞死病病原的檢測方法，其特征在于：所述RT-ERA引物組的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1-2所示。

4.如權利要求1所述的一種基于ERA技術的急性肝胰腺壞死病病原的檢測方法，其特征在于：所述RT-ERA熒光型探針的序列長度為46-52個核甘酸，RT-ERA熒光型探針序列中，含有THF殘基、dT-熒光團和dT-淬滅團取代靶標擴增子序列內的堿基。

5.如權利要求4所述的一種基于ERA技術的急性肝胰腺壞死病病原的檢測方法，其特征在于：所述RT-ERA熒光型探針的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:3-4所示。

6.如權利要求1所述的一種基于ERA技術的急性肝胰腺壞死病病原的檢測方法，其特征在于：所述RT-ERA檢測方法，具體步驟如下：

(1)RT-ERA擴增：配制RT-ERA反應管：取溶解劑、RT-ERA引物組、RT-ERA熒光型探針、模板和ddH₂0；加入含ERA反應試劑的RT-ERA反應管中，震蕩混勻，并在每個反應管蓋上加入激活劑，離心混勻后迅速將反應管置于便攜式熒光擴增檢測儀器中，33℃-42℃下進行恒溫RT-ERA擴增反應，得到RT-ERA擴增產物；

(2)熒光信號檢測：若在RT-ERA擴增的15min內擴增曲線的熒光信號值超過閾值且出現拐點，則表明擴增結果為感染或候選感染ANPND；若RT-ERA擴增產物不滿足上述條件，則表明擴增結果顯示為未感染或候選未感染AHPND。

7.如權利要求6所述的一種基于ERA技術的急性肝胰腺壞死病病原的檢測方法，其特征在于：所述RT-ERA反應管中，包括20μL溶解劑、濃度為10μM的RT-ERA引物組2μL、濃度為10μM的探針0.6μL、2μL模板和21.4μL?ddH₂0；激活劑用量為2μL。

8.一種如權利要求1-3中任意一項所述的基于ERA技術的急性肝胰腺壞死病病原的檢測方法，在對蝦急性肝胰腺壞死病的預防和控制中的應用。