[發明專利]一種抗菌肽CECTm及其制備與應用

在審

• 申請號: 202211327799.6
• 申請日: 2022-10-27
• 公開（公告）號: CN115947792A
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發明（設計）人: 劉忠淵;彭翠;劉陽;毛新芳;稅良勇;趙忠祎;謝曉倩;馮印
• 申請（專利權）人: 四川輕化工大學
• 主分類號: C07K14/00
• 分類號: C07K14/00;C12N15/78;C12N1/21;C12R1/38
• 代理公司: 西安鼎邁知識產權代理事務所(普通合伙) 61263
• 代理人: 劉喜保

本發明公開了一種抗菌肽CECTm及其制備與應用，針對編碼抗菌肽CECTm的核苷酸SEQ?ID?No.1所示，針對抗菌肽CECTm的氨基酸如SEQ?ID?No.2所示，將融合抗菌肽CECTm基因亞克隆至質粒pGAPZαC上，用BglII酶切使之線性化，采用LiCl或電轉法轉化假單胞菌。轉化子經錐形瓶發酵表達獲得抗菌肽。并提供了最佳發酵培養基配方。通過本申請提供的融合抗菌肽CECTm具有很強的熱穩定性，抗菌譜廣，能夠殺滅革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，優化后的抗菌肽的平均效價是352.5AU/mL，是優化前效價(142.06AU/mL)的2.48倍。本申請所提供的抗菌肽CECTm能夠為在農業、畜牧業、醫療衛生等方面的應用奠定基礎。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及抗菌肽制備大技術領域，更具體的涉及一種抗菌肽CECTm及其制備與應用的技術領域。

背景技術

抗菌肽是一類可誘導的、小分子量、熱穩定性、具有廣譜抗菌活性的可溶性多肽，抗菌肽不僅對一些革蘭氏陽性菌及陰性菌有很高的抗菌活力，尤其是對耐藥菌株有明顯抑殺作用，如能殺死抗多種抗生素的致病性的乙酸鈣不動桿菌，更為重要的是抗菌肽僅作用于原核細胞及發生病變的真核細胞，對真核細胞幾乎沒有作用，對高等動物機體正常細胞無損傷，這可能與細胞膜和骨架上的組成有關。對真菌、原蟲、腫瘤細胞及病毒亦有抑殺作用。抗菌肽作用機制獨特，無致畸變作用，無蓄積毒性，還不容易產生抗藥性在面臨抗藥性和篩選新的抗生素極端困難的情況下，昆蟲抗菌肽可能成為抗生素的新來源，可望成為新一代的抗菌、抗病毒、抗癌藥物。

近年來，對抗菌肽的研究越來越重視。一方面在分子水平上研究抗菌肽在生物免疫防御系統中精細的合成過程及其調控機制；另一方面，也是更重要的方面，研究抗菌肽的開發應用價值，使之成為繼青霉素等傳統抗生素之后又一類重要的新型抗菌藥物，為解決細菌對青霉素等傳統抗生素日益增強的耐藥性這一棘手的難題提供新思路。

科學界20多年圍繞著抗菌肽的發現、抑菌機制和對哺乳動物的安全性等方面進行了大量的研究，發現抗菌肽在抑制病原菌、中和細菌毒素、調節腸道免疫、改善腸道健康和促進動物生長方面具有明確的作用，抗菌肽難產生耐藥性且無殘留，可廣泛應用于畜牧業生產中。尤其是在2020年7月1日，飼料禁抗政策正式實施，我國飼料禁抗新時代來臨，從抗菌肽活性和性價比來看，抗菌肽是一款優秀的替抗產品。

目前抗菌肽的生產方式主要有三種：天然提取、化學合成和生物工程發酵。天然抗菌肽主要來自動植物，含量極低，提取過程復雜，化學合成方法高昂，每公斤成本上千萬人民幣，不適合工業化生產，無法廣泛普及應用。此外，大部分抗菌肽穩定性還不夠理想，大規模生產的主要限制條件之一就是成本問題。

發明內容

針對現有技術中大部分抗菌肽穩定性不夠理想，成本較高，大規模生產的受限的技術現狀，本申請旨在提供一種抗菌肽CECTm、及其制備與應用，本發明針對抗菌肽的活性、穩定性、成本問題，設計合成了新的抗菌肽基因，轉化假單胞菌，誘導表達后，其多肽的二級結構具有α-螺旋結構，帶有正電荷，熱穩定性強，抗菌譜廣，并且通過優化培養條件獲得抗菌肽的平均效價是352.5AU/mL，是優化前效價(142.06AU/mL)的2.48倍。本申請所提供的抗菌肽能夠為抗菌肽在農業、畜牧業、醫療衛生等方面的應用奠定基礎。

本發明通過以下技術方案實現的：

本發明提供一種抗菌肽CECTm，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

所述的抗菌肽CECTm，編碼所述抗菌肽CECTm的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

進一步的，本發明還提供抗菌肽CECTm的制備方法，所述制備方法，采用如下步驟制備獲得：

(1)人工合成N端含有EcoRI接頭、C端含有Hind?III接頭的CECTm基因片段，用限制性內切酶EcoRI和Hind?III雙酶切CECTm基因片段，形成粘性末端；