[發明專利]一種抗菌肽CECTm及其制備與應用

在審

• 申請號: 202211327799.6
• 申請日: 2022-10-27
• 公開（公告）號: CN115947792A
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發明（設計）人: 劉忠淵;彭翠;劉陽;毛新芳;稅良勇;趙忠祎;謝曉倩;馮印
• 申請（專利權）人: 四川輕化工大學
• 主分類號: C07K14/00
• 分類號: C07K14/00;C12N15/78;C12N1/21;C12R1/38
• 代理公司: 西安鼎邁知識產權代理事務所(普通合伙) 61263
• 代理人: 劉喜保

1.一種抗菌肽CECTm，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

2.如權利要求1所述的抗菌肽CECTm，其特征在于，編碼所述抗菌肽CECTm的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

3.如權利要求1所述的抗菌肽CECTm的制備方法，其特征在于，采用如下步驟制備獲得：

(1)人工合成N端含有EcoRI接頭、C端含有Hind?III接頭的CECTm基因片段，用限制性內切酶EcoRI和Hind?III雙酶切CECTm基因片段，形成粘性末端；

(2)采用ddH₂O?25μL，10×Buffer?5μL，CECTm?15μL，EcoRI?2.5μL，Hind?III?2.5μL，反應體系，37℃恒溫，孵育4-6h；

(3)使用限制性內切酶EcoRI和Hind?III雙酶切pET32a質粒載體，ddH₂O?11μL，10×Buffer?2μL，pET32a?5μL，EcoRI?1μL，NotI?1μL反應體系，37℃恒溫，孵育4-6h；

(4)將步驟(3)中雙酶切后的pET32a和步驟(2)中獲得的CECTm片段，經T₄?DNA連接酶在4℃連接過夜，連接產物pET32a-CECTm轉化E.coli?DH5α感受態細胞，抗生素篩選，挑取陽性克隆進行菌液PCR鑒定、測序鑒定；

(5)采用ddH₂O?25μL；10×Buffer?5μL；步驟(4)中構建成功獲得的pET32a-CECTm?15μL；EcoRI?2.5μL；NotI?2.5μL；37℃恒溫，孵育4-6h，切下CECTm基因；

(6)采用ddH₂O?11μL；10×Buffer?2μL；pGAPZαC?5μL；EcoRI?1μL；NotI?1μL；37℃恒溫，孵育4-6h切pGAPZαC；

(7)將步驟(6)及步驟(5)中雙酶切后的pGAPZαC和CECTm片段，經T₄DNA連接酶在4℃連接過夜，獲得的連接產物pGAPZαC-CECTm轉化E.coliTop10感受態細胞，抗生素篩選，挑取陽性克隆進行菌液PCR鑒定、測序鑒定；

(8)將步驟(7)中的pGAPZαC-CECTm用BglII酶切切線性化后，采用鋰鹽法(LiCl)，轉化假單胞桿菌細胞，涂布在含有50-150g/mL博來霉素的YPD平板上，28-30℃孵育2-3天；

(9)清洗錐形瓶、搖菌管等所需器皿，121℃滅菌20min，70℃烘干備用；將YPD液體培養基分裝于100mL搖菌管中，每支試管5mL，并加入博來霉素10μL。將步驟(8)中平板上生長的細菌用滅菌牙簽輕輕挑起，接種于搖菌管中28-30℃，150-200rpm培養；

(10)選取步驟(9)中獲得的將1mL菌種接種于含有100mL培養基的錐形瓶中，28-30℃，150-200rpm培養4h-6h，測OD600值，OD600處于0.6-0.8之間時，28-30℃，150rpm繼續培養4-8h，即可分離獲得抗菌肽CECTm。

4.一種用于制備如權利要求1所述的抗菌肽CECTm的發酵培養基，其特征在于，所述發酵培養基中的碳源為5g/L-50g/L葡萄糖。

5.如權利要求4所述的用于制備抗菌肽CECTm的發酵培養基，其特征在于，所述發酵培養基中的氮源為0.5g/L-20g/L硫酸銨。

6.如權利要求4所述的用于制備抗菌肽CECTm的發酵培養基，其特征在于，所述發酵培養基中的無機鹽為10g/L-20g/L?Na₂HPO₄·10H₂O、5g/L-15g/L?KH₂PO₄、0.01g/L-0.1g/LCaCl₂、0.25g/L-1g/L?MgSO₄。