[發明專利]一種熱穩定性增強的D-甘露糖異構酶突變體

在審

• 申請號: 202211327476.7
• 申請日: 2022-10-27
• 公開（公告）號: CN115820617A
• 公開（公告）日: 2023-03-21
• 發明（設計）人: 丁重陽;沈玲;趙麗婷;陳磊;馬忠寶;徐萌萌;顧正華;李由然;徐沙;石貴陽
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/90
• 分類號: C12N9/90;C12N15/61;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/24;C12P19/02;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發明公開了一種熱穩定性增強的D?甘露糖異構酶突變體，屬于酶工程領域。本發明提供了熱穩定性提高的D?甘露糖異構酶突變體，所述D?甘露糖異構酶突變體的氨基酸序列相對于SEQ ID NO：1在第241位、第116位、第379位或第253位是不同的。其中，D?甘露糖異構酶突變體A241P與親本酶相比，比酶活和穩定性均有提高，50℃條件下半衰期從18.87min提高到了43.35min，比酶活比提高了150％。

技術領域

本發明涉及一種熱穩定性增強的D-甘露糖異構酶突變體，屬于酶工程領域。

背景技術

隨著現代社會的發展，生活水平的提高，人們開始關注功能性糖及其在健康方面的應用。功能性糖作為蔗糖替代劑，因其獨特的生理功能，在食品、制藥和保健等領域有廣闊的前景。

D-甘露糖是功能性糖之一，有許多生理益處：作為功能性甜味劑，具有益生元功能；通過對T細胞的免疫調節進而抑制I型糖尿病和肺氣道炎癥；增強傷口愈合、避免細菌感染；合成維生素、抗腫瘤藥物和免疫刺激藥物的重要前體物質之一。

目前D-甘露糖的制備主要包括植物提取法、化學合成法以及生物酶法三種途徑。植物提取法雖然在目前應用較多，但是其受原料供應不足、季節、氣候等的影響較大，同時也不利于環境保護；化學合成法工藝復雜，生產成本高，生產過程中易產生大量酸性廢液污染環境，且最終分離提純D-甘露糖較困難；而生物酶法反應條件溫和、副產物少、易分離純化、不污染環境和成本低。因此，利用生物酶法制備D-甘露糖成為未來的研究趨勢。

甘露糖異構酶是可以催化甘露糖和果糖之間的可逆異構反應。目前D-甘露糖異構酶(D-Mannose Isomerase,EC 5.3.1.7)是生物酶法制備D-甘露糖中應用最廣的酶，但是研究發現大部分細菌來源的D-甘露糖異構酶普遍存在熱穩定性低的問題。例如大腸桿菌BL21來源的D-甘露糖異構酶在50℃以上酶活迅速降低，但是50℃下其半衰期仍然超過4h。除此以外，多數其他細菌來源的酶，如Pseudomonas syringae來源的在50℃保溫半小時后測得酶活僅剩10％左右，Saccharothrix sp.CMU-K747來源的在50℃保溫1小時后測得酶活僅剩5％左右。而在工業生產中，恰恰需要酶具有較好的熱穩定性。因此，保證D-甘露糖異構酶的活性不變的同時提高熱穩定性對于工業制備D-甘露糖具有非常重要的意義。

發明內容

[技術問題]

本發明要解決的技術問題是大腸桿菌來源的D-甘露糖異構酶普遍存在熱穩定性差的問題。

[技術方案]

本發明提供了熱穩定性提高的D-甘露糖異構酶突變體，所述D-甘露糖異構酶突變體的氨基酸序列相對于SEQ ID NO.1在第241位、第116位、第379位或第253位是不同的。

在本發明的一種實施方式中，所述D-甘露糖異構酶突變體的親本來源于Escherichia coli DH5α。

在本發明的一種實施方式中，編碼所述D-甘露糖異構酶的親本的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本發明的一種實施方式中，相對于SEQ ID NO.1，所述D-甘露糖異構酶突變體的氨基酸序列在第241位是脯氨酸，所述D-甘露糖異構酶突變體命名為：A241P。

在本發明的一種實施方式中，相對于SEQ ID NO.1，所述D-甘露糖異構酶突變體的氨基酸序列在第116位是纈氨酸，所述D-甘露糖異構酶突變體命名為：A116V。

在本發明的一種實施方式中，相對于SEQ ID NO.1，所述D-甘露糖異構酶突變體的氨基酸序列在第379位是脯氨酸，所述D-甘露糖異構酶突變體命名為：Q379P。