[發明專利]一種AAVS1:Brainbow敲入的人胚胎干細胞系及其構建方法與應用

在審

• 申請號: 202211324850.8
• 申請日: 2022-10-27
• 公開（公告）號: CN116064542A
• 公開（公告）日: 2023-05-05
• 發明（設計）人: 劉軍;鄭雯;鐘亞丹;楊斌
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學皮膚病醫院（廣東省皮膚病醫院;廣東省皮膚性病防治中心;中國麻風防治研究中心）
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/12;C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 廣州凱東知識產權代理有限公司 44259
• 代理人: 曾志環

本發明公開了一種AAVS1:Brainbow敲入的人胚胎干細胞系及其構建方法與應用，步驟包括：構建sgRNA表達質粒、打靶Donor載體，將sgRNA質粒、Cas9質粒和打靶Doner載體共同電轉H9人胚胎干細胞系，鏡下觀察并挑選并驗證，得到AAVS1:Brainbow敲入的人胚胎干細胞系。本發明優點包括：結合CreERT2/Loxp技術可以在該細胞系上對特定的細胞群進行標記，并在人胚胎干細胞3D培養分化過程中實現對單細胞的譜系追蹤，用于在類器官水平研究胚胎干細胞到成體細胞分化和發育過程。

技術領域

本發明屬于發育生物學領域，具體涉及一種Brainbow敲入的人胚胎干細系技術。

背景技術

人胚胎干細胞(Human?embryonic?stem?cell，hESCs)是早期胚胎或原始性腺中分離出來的一類細胞，它具有體外培養無限增殖、自我更新和多向分化的特性。將hESCs培養在支持介質(如基質膠)上，通過在特定培養基中添加不同的細胞因子，使hESCs能夠在體外擴增和分化為多種細胞類型，用于體外3D培養建立機體多種系統的類器官模型。

人類第19號染色體上的AAVS1位點(又名為PPP1R2C位點)是一個開放的染色體結構，能保證轉入的基因能被正常轉錄。經過驗證，該位點中轉入的DNA片段能發揮其預期功能，且在該位點插入外源基因片段對細胞無傷害。靶向AAVS1位點的CRISPR-Cas9系統能特異性剪切AAVS1位點，生成DNA雙鏈斷裂，誘導DNA同源重組修復，將供體克隆上的DNA片段整合到基因組的AAVS1位點上。

Brainbow中編碼熒光蛋白的基因與單個啟動子串聯在一起，緊挨著啟動子的基因能夠正常表達。Brainbow?2.1版本使用綠色熒光蛋白(GFP)、紅色熒光蛋白(RFP)、黃色熒光蛋白(YFP)和青色熒光蛋白(CFP)，GFP緊挨著啟動子，因此細胞在默認情況下發出綠色熒光。若通過Cre介導的重組允許下游編碼其他熒光蛋白的基因表達，能使子代細胞隨機表達GFP、RFP、YFP和CFP。這種技術可以通過構建含多色熒光蛋白(XFP)的重組載體，利用它來標記器官或生物體，載體上的隨機重組使細胞呈現出獨特的顏色，并且子代細胞都保留這種顏色，可用于標記特定的細胞群并實現對單細胞進行譜系追蹤，實現在類器官水平上研究胚胎干細胞到成體細胞分化和發育過程的目的。

發明內容

本發明的目的是提供一種AAVS1:Brainbow敲入的人胚胎干細胞系及其構建方法與應用，該細胞系可應用于標記特定的細胞群并實現對單細胞進行譜系追蹤，在類器官水平上研究胚胎干細胞到成體細胞分化和發育的過程。

本發明解決技術問題的方案如下：

本發明提供一種靶向AAVS1位點的sgRNA，sgRNA的DNA序列如SEQ?ID?NO.1所示。

本發明提供一種含有如權利要求1所述的靶向AAVS1位點的sgRNA的sgRNA質粒。

本發明提供一對與AAVS1切割位點上下游序列相同的同源臂，包括與AAVS1切割位點上游序列相同的AAVS1同源臂1，其DNA序列如SEQ?ID?NO.2所示，以及包括與AAVS1切割位點下游序列相同的AAVS1同源臂2，其序列如SEQ?ID?NO.3所示。

本發明提供一種含有所述一對與AAVS1切割位點上下游序列相同的同源臂的質粒。

本發明提供一種打靶Donor載體，其具有：

與AAVS1切割位點上游序列相同的AAVS1同源臂1、與AAVS1切割位點下游序列相同的AAVS1同源臂2，以及位于AAVS1同源臂1和AAVS1同源臂2之間的待重組入AAVS1位點的編碼多色熒光蛋白的基因。

AAVS1同源臂1的序列如SEQ?ID?NO.2所示，AAVS1同源臂2的序列如SEQ?ID?NO.3所示；打靶Donor載體的特異性DNA序列包含AAVS1同源臂1、編碼多色熒光蛋白的基因、AAVS1同源臂2。