[發(fā)明專利]一種AAVS1:Brainbow敲入的人胚胎干細(xì)胞系及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202211324850.8
• 申請(qǐng)日: 2022-10-27
• 公開（公告）號(hào): CN116064542A
• 公開（公告）日: 2023-05-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉軍;鄭雯;鐘亞丹;楊斌
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院（廣東省皮膚病醫(yī)院;廣東省皮膚性病防治中心;中國麻風(fēng)防治研究中心）
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/12;C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 廣州凱東知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44259
• 代理人: 曾志環(huán)

1.一種靶向AAVS1位點(diǎn)的sgRNA，其特征在于，sgRNA的DNA序列如SEQ?ID?NO.1所示。

2.一種含有如權(quán)利要求1所述的靶向AAVS1位點(diǎn)的sgRNA的sgRNA質(zhì)粒。

3.一對(duì)與AAVS1切割位點(diǎn)上下游序列相同的同源臂，其特征在于，包括與AAVS1切割位點(diǎn)上游序列相同的AAVS1同源臂1，其DNA序列如SEQ?ID?NO.2所示，以及包括與AAVS1切割位點(diǎn)下游序列相同的AAVS1同源臂2，其序列如SEQ?ID?NO.3所示。

4.一種含有如權(quán)利要求4所述一對(duì)與AAVS1切割位點(diǎn)上下游序列相同的同源臂的質(zhì)粒。

5.一種打靶Donor載體，其特征在于，其具有：

與AAVS1切割位點(diǎn)上游序列相同的AAVS1同源臂1、與AAVS1切割位點(diǎn)下游序列相同的AAVS1同源臂2，以及位于AAVS1同源臂1和AAVS1同源臂2之間的待重組入AAVS1位點(diǎn)的編碼多色熒光蛋白的基因，

AAVS1同源臂1的序列如SEQ?ID?NO.2所示，AAVS1同源臂2的序列如SEQ?ID?NO.3所示；打靶Donor載體的特異性DNA序列包含AAVS1同源臂1、編碼多色熒光蛋白的基因、AAVS1同源臂2。

6.一種AAVS1:Brainbow敲入的人胚胎干細(xì)胞系，其特征在于，人胚胎干細(xì)胞系的AAVS1位點(diǎn)敲入了編碼多色熒光蛋白的基因。

7.一種如權(quán)利要求6所述AAVS1:Brainbow敲入的人胚胎干細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)針對(duì)AAVS1位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成相應(yīng)的sgRNA，并構(gòu)建sgRNA質(zhì)粒；

(2)設(shè)計(jì)與AAVS1位點(diǎn)上游序列相同的AAVS1同源臂1、與AAVS1位點(diǎn)下游序列相同的AAVS1同源臂2，構(gòu)建帶同源臂的質(zhì)粒；

(3)將編碼多色熒光蛋白的基因連至帶同源臂的質(zhì)粒構(gòu)成打靶Donor載體；

(4)將sgRNA質(zhì)粒、Cas9質(zhì)粒和打靶Donor載體共同電轉(zhuǎn)H9人胚胎干細(xì)胞系，培養(yǎng)得到AAVS1:Brainbow敲入的人胚胎干細(xì)胞系。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述一種AAVS1:Brainbow敲入的人胚胎干細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，詳細(xì)過程如下：

(1)針對(duì)AAVS1位點(diǎn)設(shè)計(jì)并合成相應(yīng)的sgRNA，室溫退火后連入經(jīng)BsmBI單酶切的pU6-EFsgRNA2.0scaffold載體，篩選后獲得最高切割活性的sgRNA質(zhì)粒，其sgRNA的DNA序列如SEQ?ID?NO.1所示；

(2)設(shè)計(jì)與AAVS1位點(diǎn)上游序列相同的AAVS1同源臂1、與AAVS1位點(diǎn)下游序列相同的AAVS1同源臂2，AAVS1同源臂1的DNA序列如SEQ?ID?NO.2所示，AAVS1同源臂2的DNA序列如SEQ?ID?NO.3所示，將AAVS1同源臂1和AAVS1同源臂2克隆至Donor載體中，得到帶有同源臂的Donor質(zhì)粒；

(3)將編碼多色熒光蛋白的基因連至帶有同源臂的Donor質(zhì)粒中，構(gòu)成靶向AAVS1位點(diǎn)的打靶Donor載體；

(4)將sgRNA質(zhì)粒，Cas9質(zhì)粒和打靶Donor載體按數(shù)量比例為1:4:10共同電轉(zhuǎn)H9人胚胎干細(xì)胞系，培養(yǎng)48小時(shí)后加入1μg/ml的嘌呤霉素培養(yǎng)24小時(shí)，通過有限稀釋法將80個(gè)單克隆細(xì)胞鋪于96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)半個(gè)月后，將挑取的單克隆細(xì)胞轉(zhuǎn)至24孔板進(jìn)行培養(yǎng)，鏡下觀察并挑選出表達(dá)入核GFP熒光蛋白的重組單克隆細(xì)胞，得到AAVS1:Brainbow敲入的人胚胎干細(xì)胞系。

9.一種如權(quán)利要求6-8任一所述AAVS1:Brainbow敲入的人胚胎干細(xì)胞系在人胚胎干細(xì)胞3D培養(yǎng)分化過程中對(duì)單細(xì)胞的譜系追蹤以及在類器官水平研究胚胎干細(xì)胞到成體細(xì)胞分化和發(fā)育過程的應(yīng)用。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，結(jié)合CreERT2/Loxp技術(shù)，在AAVS1:Brainbow敲入的人胚胎干細(xì)胞系中介導(dǎo)重組允許下游編碼其他熒光蛋白的基因表達(dá)，使AAVS1:Brainbow敲入的人胚胎干細(xì)胞系的子代細(xì)胞隨機(jī)表達(dá)不同的熒光蛋白，在所述細(xì)胞系上對(duì)特定的細(xì)胞群進(jìn)行標(biāo)記以及追蹤發(fā)育情況。