[發明專利]口蝦蛄致敏蛋白AK的突變體及其應用

在審

• 申請號: 202211320812.5
• 申請日: 2022-10-26
• 公開（公告）號: CN115851658A
• 公開（公告）日: 2023-03-28
• 發明（設計）人: 劉光明;陳業欣;何欣蓉;楊陽;桓霏;楊世強;劉紅
• 申請（專利權）人: 集美大學
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/54;C12N15/70;A61K39/35;A61P37/08
• 代理公司: 廈門創象知識產權代理有限公司 35232
• 代理人: 王鳳玲;尤懷成

本發明提供了一種口蝦蛄致敏蛋白AK的突變體及其應用，所述突變體是將口蝦蛄致敏蛋白AK氨基酸序列的第197位丙氨酸刪除，所述口蝦蛄致敏蛋白AK突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。根據本發明的口蝦蛄致敏蛋白AK的突變體，通過重疊延伸聚合酶鏈式反應技術獲得口蝦蛄AK突變體的基因序列；將突變體的基因與重組表達載體連接，轉入宿主細胞中誘導表達，獲得口蝦蛄AK突變體D?A197；與AK相比，D?A197的IgE結合活性顯著降低，有望用于免疫治療或免疫預防，提高預防治療的安全指數。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種口蝦蛄致敏蛋白AK的突變體及其應用。

背景技術

過敏性疾病是一種嚴重影響人體健康的全球性問題，近年來，在世界范圍內由食物引起的過敏發病率逐年上升，食物過敏已成為全球關注的食品安全和公共衛生問題，被稱為繼哮喘之后的“第二波”過敏流行病。

甲殼類水產品中口蝦蛄又名皮皮蝦，具有重要的營養價值與經濟價值，深受沿海居民的喜愛，但由其引發的過敏反應逐年遞增。目前，致敏原特異性免疫治療是臨床上較為公認的免疫治療措施，通過低劑量、長時間暴露于致敏原，不斷刺激機體的耐受能力以誘導其耐受，但同時也伴隨副作用的產生。利用低致敏性的過敏原制劑，可以大大減少免疫治療中的副作用，提高治療的安全系數。

關于口蝦蛄致敏蛋白的改造未見報道，而精氨酸激酶(arginine kinase,AK)是蝦類主要致敏原，且作為甲殼類水產品中泛過敏原，能夠引起廣泛的交叉反應。因此，對蝦類致敏蛋白AK的改造值得深入研究。

發明內容

本發明旨在至少在一定程度上解決上述技術中的技術問題之一。為此，本發明的第一個目的在于提供一種口蝦蛄致敏蛋白AK的突變體。

本發明的第二個目的是提出一種編碼口蝦蛄致敏蛋白AK的突變體的基因。

本發明的第三個目的是提出一種重組載體。

本發明的第四個目的是提出一種制備口蝦蛄致敏蛋白AK的突變體的方法。

本發明的第五個目的是提出一種口蝦蛄致敏蛋白AK的突變體的應用。

在本發明的第一個方面中，提供了一種口蝦蛄致敏蛋白AK的突變體，所述突變體是將口蝦蛄致敏蛋白AK氨基酸序列的第197位丙氨酸刪除，所述口蝦蛄致敏蛋白AK突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

根據本發明的實施例，將口蝦蛄致敏蛋白AK氨基酸序列的第197位丙氨酸刪除，可獲得低致敏性的突變體，該突變體與IgE的結合活性降低，可用于免疫治療或免疫預防。

在本發明的第二方面中，提供了一種編碼口蝦蛄致敏蛋白AK的突變體的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

在本發明的第三個方面中，提供了一種重組載體，其包含編碼上述口蝦蛄致敏蛋白AK的突變體的基因。

在本發明的第四方面中，根據本發明實施例，提供了一種制備口蝦蛄致敏蛋白AK的突變體的方法，包括以下步驟：

(1)以pET-22b-AK菌株所得的質粒為模板，SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10為引物進行重疊延伸PCR第一輪擴增，獲得第一產物；

(2)以所述第一產物模板，SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8為引物進行重疊延伸PCR第二輪擴增，獲得第二產物，所述第二產物經擴增回收，獲得突變基因；

(3)將所述突變基因克隆入原核表達載體中，構建重組載體；

(4)將所述重組載體轉入宿主菌，誘導其表達并純化蛋白，以獲得所述突變體。

可選地，所述pET-22b-AK菌株的制備包括：