[發明專利]一種自體癌性胸腹水來源的腫瘤浸潤T淋巴細胞的擴增方法

在審

• 申請號: 202211320664.7
• 申請日: 2022-10-26
• 公開（公告）號: CN115558640A
• 公開（公告）日: 2023-01-03
• 發明（設計）人: 張蕊;姚含秉;王剛鋒;梁英民
• 申請（專利權）人: 西安國際醫學中心有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 西安研創天下知識產權代理事務所(普通合伙) 61239
• 代理人: 王文煥

本發明公開了一種自體癌性胸腹水來源的腫瘤浸潤T淋巴細胞的擴增方法，屬于細胞分離與培養技術領域，包括以下步驟：S1、自體胸腹水的采集；S2、待分選樣本的準備；S3、分選磁珠的添加；S4、洗脫和上樣；S5、非目標細胞的洗脫及目標細胞洗脫與收集；S6、腫瘤浸潤T淋巴細胞的體外激活；S7、腫瘤浸潤T淋巴細胞的體外擴增；S8、腫瘤浸潤T淋巴細胞的鑒定和收獲。本發明提供的擴增方法通過利用偶聯CD3/CD28抗體的納米級別顆粒激活分選純化獲得的腫瘤浸潤T淋巴細胞，能夠充分激活TIL細胞，使得TIL細胞的增殖能力得到了大幅度的提升，能夠保證在培養結束時獲得足量的TIL細胞。

技術領域

本發明屬于細胞分離與培養技術領域，具體涉及一種自體癌性胸腹水來源的腫瘤浸潤T淋巴細胞的擴增方法。

背景技術

隨著人口老齡化的加劇，在未來，我國癌癥發病以及死亡的情況不容樂觀。因此臨床上急需新的治療手段去攻克腫瘤治療這個世界性難題。

腫瘤的發生是體細胞基因突變的結果，通常機體的免疫系統會監控到這類異常體細胞的存在并通過細胞毒性作用將其消滅。但不幸的是腫瘤細胞不僅能夠通過多種機制逃逸免疫系統的識別與攻擊還可以通過腫瘤免疫微環境抑制免疫細胞發揮功能，為其進一步生長擴散提供條件，由此可見機體的免疫功能在腫瘤的發生發展中起著至關重要的作用，因此腫瘤免疫治療技術應運而生。

目前腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)療法已成為實體瘤治療領域的新星。其原理是將來源于患者腫瘤組織或癌性胸腹水中的腫瘤浸潤淋巴細胞，主要是CD8⁺T淋巴細胞提取出來，經過體外的大量擴增再回輸入患者體內，接著需要銜接IL-2的注射以維持TIL細胞的活性。進入患者體內的TIL細胞能夠有效遷移到腫瘤病灶處，在特異性識別腫瘤細胞之后發揮抗腫瘤作用。和其他的細胞治療方法相比，TIL細胞殺傷癌細胞的過程具有特異性強、靈敏度高，腫瘤趨化性好以及機體耐受性好的巨大優勢。TIL細胞療法已經在黑色素瘤領域取得了舉世矚目的治療效果，總有效率約為50％，而且高達25％的患者在接受治療后維持著持久的完全緩解。

TIL療法成功的首要關鍵問題在于如何能夠在一定時間內在體外擴增出大量以及抗腫瘤活性強的TIL細胞，然而在進行TIL細胞的體外擴增時通常會遇到兩大問題：其一是TIL的來源問題，如果從腫瘤組織中獲取TIL細胞，牽扯到需要臨床配合以及腫瘤組織消化操作的復雜性，不僅患者的篩選條件苛刻，導致大量患者無法接受TIL療法，還會損失大量的原始TIL細胞導致最終獲得的TIL細胞數量減少；其二是因為長期處于腫瘤細胞營造的免疫抑制環境中， TIL細胞的增殖能力受到了嚴重的抑制從而導致最終獲得的TIL細胞數量減少。本發明針對上述兩個問題，提供了一種自體癌性胸腹水來源的腫瘤浸潤 T淋巴細胞的擴增方法。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種自體癌性胸腹水來源的腫瘤浸潤T淋巴細胞的擴增方法。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案是：

一種自體癌性胸腹水來源的腫瘤浸潤T淋巴細胞的擴增方法，包括以下步驟：

S1、自體胸腹水的采集：無菌收集患者自體胸腹水，離心，收集細胞沉淀；

S2、待分選樣本的準備：加入分選緩沖液對步驟S1收集的細胞沉淀進行吹打沖洗，接著離心，去除上清，再加入分選緩沖液對細胞沉淀進行重懸，得到細胞懸液，對細胞懸液進行細胞計數，根據計數結果通過加入分選緩沖液對細胞懸液進行處理，得到細胞懸液反應液；

S3、分選磁珠的添加：向步驟S2得到的細胞懸液反應液中加入分選磁珠，混合均勻，于2-4℃孵育15-20min，孵育結束后，得到混合物；

S4、洗脫和上樣：向步驟S3得到的混合物中加入分選緩沖液進行洗脫，洗脫完成后，棄掉上清后，用分選緩沖液將總細胞濃度調整為1.5-2×10^8/ml，得到細胞磁珠混合懸液，然后進行上樣操作；