[發(fā)明專利]一種自體癌性胸腹水來源的腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202211320664.7
• 申請日: 2022-10-26
• 公開（公告）號: CN115558640A
• 公開（公告）日: 2023-01-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張蕊;姚含秉;王剛鋒;梁英民
• 申請（專利權(quán)）人: 西安國際醫(yī)學(xué)中心有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 西安研創(chuàng)天下知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 61239
• 代理人: 王文煥

1.一種自體癌性胸腹水來源的腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、自體胸腹水的采集：無菌收集患者自體胸腹水，離心，收集細(xì)胞沉淀；

S2、待分選樣本的準(zhǔn)備：加入分選緩沖液對步驟S1收集的細(xì)胞沉淀進(jìn)行吹打沖洗，接著離心，去除上清，再加入分選緩沖液對細(xì)胞沉淀進(jìn)行重懸，得到細(xì)胞懸液，對細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果通過加入分選緩沖液對細(xì)胞懸液進(jìn)行處理，得到細(xì)胞懸液反應(yīng)液；

S3、分選磁珠的添加：向步驟S2得到的細(xì)胞懸液反應(yīng)液中加入分選磁珠，混合均勻，于2-4℃孵育15-20min，孵育結(jié)束后，得到混合物；

S4、洗脫和上樣：向步驟S3得到的混合物中加入分選緩沖液進(jìn)行洗脫，洗脫完成后，棄掉上清后，用分選緩沖液將總細(xì)胞濃度調(diào)整為1.5-2×10^8/ml，得到細(xì)胞磁珠混合懸液，然后進(jìn)行上樣操作；

S5、非目標(biāo)細(xì)胞的洗脫及目標(biāo)細(xì)胞洗脫與收集：在步驟S4上樣操作完成后，通過分選緩沖液依次進(jìn)行非目標(biāo)細(xì)胞和目標(biāo)細(xì)胞的洗脫，然后對目標(biāo)細(xì)胞懸浮液進(jìn)行收集，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，確定目標(biāo)細(xì)胞數(shù)量以及活率，當(dāng)目標(biāo)細(xì)胞活率和CD3陽性率達(dá)到分選純化的要求時，得到分選純化后的腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞懸液；

S6、腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞的體外激活：將步驟S5得到的腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞懸液離心并棄掉上清后，得到腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞沉淀，對腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞沉淀進(jìn)行吹打清洗，接著離心并棄掉上清后，重懸細(xì)胞沉淀，得到細(xì)胞懸液，然后加入激活試劑，混合均勻后，添加至細(xì)胞培養(yǎng)板中，孵育2-3天，得到激活后的細(xì)胞；

S7、腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞的體外擴(kuò)增：收集步驟S6得到的激活后的細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，接著離心棄掉上清后，重懸細(xì)胞沉淀，并置于細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)，然后每隔一天對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果將活細(xì)胞濃度重新調(diào)整為1-1.5×10^6/ml，并添加細(xì)胞因子IL-2，在常規(guī)培養(yǎng)過程中，根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)體積將培養(yǎng)的細(xì)胞從細(xì)胞板依次轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶和細(xì)胞培養(yǎng)袋中進(jìn)行培養(yǎng)；

S8、腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞的鑒定和收獲：培養(yǎng)兩周后，可根據(jù)需要對培養(yǎng)完成的腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞進(jìn)行鑒定和收獲。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自體癌性胸腹水來源的腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增方法，其特征在于，步驟S2、步驟S4和步驟S5中，所述分選緩沖液為1×PBS+0.5％FBS+2mM EDTA，且所述分選緩沖液于4℃使用。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自體癌性胸腹水來源的腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增方法，其特征在于，步驟S2中，所述根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果通過加入分選緩沖液對細(xì)胞懸液進(jìn)行處理具體為：當(dāng)細(xì)胞懸液中細(xì)胞的密度大于1×10^8/ml時，向細(xì)胞懸液中加入分選緩沖液將總細(xì)胞濃度調(diào)整為1×10^8/ml。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自體癌性胸腹水來源的腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增方法，其特征在于，步驟S3中，所述步驟S2得到的細(xì)胞懸液反應(yīng)液與分選磁珠的加入量的體積比為10:1。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自體癌性胸腹水來源的腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增方法，其特征在于，步驟S4中，所述上樣操作的具體步驟為：將分選柱置于磁力架上，接著向分選柱中央懸空加入分選緩沖液對分選柱進(jìn)行活化，待分選緩沖液流完后立即向分選柱中央懸空加入細(xì)胞磁珠混合懸液。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的自體癌性胸腹水來源的腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增方法，其特征在于，步驟S5中，所述非目標(biāo)細(xì)胞和目標(biāo)細(xì)胞的洗脫具體包括以下步驟：

S51、向裝載有細(xì)胞磁珠混合懸液的分選柱中央懸空加入分選緩沖液，重復(fù)上述操作多次，得到目標(biāo)細(xì)胞沉淀；

S52、將裝載有步驟S51得到的目標(biāo)細(xì)胞沉淀的分選柱從磁力架上取下，向分選柱中央懸空加入分選緩沖液，然后將其轉(zhuǎn)移至離心管中，混合均勻，收集得到目標(biāo)細(xì)胞懸液。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自體癌性胸腹水來源的腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增方法，其特征在于，步驟S5中，所述目標(biāo)細(xì)胞活率和CD3陽性率達(dá)到分選純化的要求的標(biāo)準(zhǔn)為：所述目標(biāo)細(xì)胞活率達(dá)到90％以上并且CD3陽性率達(dá)到80％以上。